教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-04-0498)
- 作品数：10 被引量：42H指数：4
- 相关作者：张荣珍穆晓清孙莹张波涛耿亚维更多>>
- 相关机构：江南大学中国科学院天津工业生物技术研究所更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学化学工程更多>>
- 一种新的高立体选择性羰基还原酶的性质及分离被引量：16
- 2006年
- 从近平滑假丝酵母(CandidaparapsilosisCCTCC203011)中分离得到了新的NADPH依赖型羰基还原酶。粗酶经硫铵分级沉淀、DEAESepharose离子交换层析、Phenyl-sepharoseFF疏水层析、BlueSepharoseFF亲和层析后在SDS-PAGE上显示为单一条带,其酶蛋白的相对分子质量为30kD。该酶还原反应的最适pH值为4.5,最适温度为35℃,Cu2+对羰基还原酶有强烈的抑制作用。该酶具有较高的底物专一性和立体选择性,对α-羟基苯乙酮和4-氯乙酰乙酸乙酯具有较高的不对称还原活力,其产物分别为(S)-苯基乙二醇和(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯,e.e值分别为100%和94.3%。因此该酶蛋白是不对称合成手性醇有效的生物催化剂之一。经LC-MASS-MASS分析得到了酶蛋白中一个肽段的氨基酸序列,通过比对发现该酶与假定蛋白(hypotheticalproteinCaO19.10414)具有一定的同源性。
- 羊明徐岩穆晓清肖荣
- 关键词：生物催化羰基还原酶分离纯化
- 定点突变改变近平滑假丝酵母SCRⅡ催化苯乙酮衍生物底物谱
- 2011年
- 【目的】通过定点突变技术,改变近平滑假丝酵母短链羰基还原酶Ⅱ(SCRⅡ)催化苯乙酮衍生物的功能,为数种手性芳香醇的生产提供一种高效、安全的新型制备方法。【方法】通过氨基酸序列和蛋白结构比对的方法,选择SCRⅡ的底物结合域中关键氨基酸位点E228实施突变,构建相应的突变株Escherichia coliBL21/pET28a-E228S;以苯乙酮衍生物为底物,对突变株的酶活和生物转化功能进行了分析。【结果】酶活测定结果表明:突变株E.coli BL21/pET28a-E228S催化原始底物2-羟基苯乙酮的酶活仅为原始酶活的25%左右;而催化苯乙酮、4'-甲基苯乙酮、4'-氯苯乙酮的酶活是突变前的7-20倍。突变株E.coli BL21/pET28a-E228S生物转化2-羟基苯乙酮,获得产物(S)-苯基乙二醇的得率不超过10%,而以苯乙酮、4'-甲基苯乙酮、4'-氯苯乙酮为底物时,生物转化产物光学纯度维持在99%,得率高达80%以上。【结论】对底物结合域中的关键氨基酸实施突变,提高了SCRⅡ催化苯乙酮衍生物的底物广谱性,拓展了该酶的生物功能,为理性改造短链羰基还原酶的不对称还原催化功能和手性芳香醇的制备提供了新型途径。
- 张波涛张荣珍王珊珊徐岩
- 关键词：定点突变生物转化手性醇
- (R)-、(S)-羰基还原酶在酿酒酵母中的表达和亚细胞定位
- 2011年
- 【目的】将增强型荧光蛋白标记的(R)-和(S)-羰基还原酶于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)细胞中表达,分析荧光蛋白表达谱,确定两种酶在细胞中的功能分布和亚细胞定位。【方法】采用SOE-PCR法克隆出增强型荧光蛋白与(R)-和(S)-羰基还原酶的融合基因,构建到真核表达载体pYX212中,电击转化酵母细胞,以荧光蛋白为筛选标志,观察两种酶在酵母细胞中的表达和分布。【结果】激光扫描共聚焦显微观察表明(R)-和(S)-羰基还原酶多定位于细胞内膜和细胞质中稳定表达,少数成点状分布于细胞中央。根据荧光强度可知(S)-羰基还原酶的表达水平明显高于(R)-羰基还原酶。生物转化结果显示融合型(R)-和(S)-羰基还原酶催化底物2-羟基苯乙酮,分别获得(R)-和(S)-苯基乙二醇,前者产物的光学纯度和产率为86.6%和70.4%,后者产物的光学纯度和产率分别为92.3%和81.8%。【讨论】荧光蛋白与酶的融合没有改变靶蛋白的分子构象与生物活性,酿酒酵母工程菌较重组大肠杆菌具有更明显的生物功能优势,该研究为羰基还原酶蛋白的功能表达调控与亚细胞定位的可视化研究奠定了坚实的基础。
- 张荣珍徐岩王珊珊张波涛耿亚维
- 关键词：羰基还原酶酿酒酵母亚细胞定位苯基乙二醇
- 羰基还原酶与甲酸脱氢酶偶联催化制备(R)-苯基乙二醇被引量：2
- 2009年
- 以重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh全细胞为催化剂,2-羟基苯乙酮和甲酸钠为双底物,研究了生物催化反应体系中温度、pH值、底物2-羟基苯乙酮的初始浓度、反应时间、细胞浓度和状态等对产物(R)-苯基乙二醇生成效率的影响规律.结果表明,在温度35℃和pH7.0、底物初始浓度6g/L、时间36h、湿细胞浓度10%(ω)的条件下,产物的光学纯度高达98.37%e.e.,得率达79.14%.在上述反应体系中添加5mmol/LZnSO4后,重组菌催化的不对称还原反应效率显著提高,产物(R)-苯基乙二醇光学纯度达到100%e.e.,得率高达86.3%.
- 张荣珍徐岩耿亚维王珊珊孙莹
- 关键词：重组大肠杆菌生物催化光学纯度
- (R)-专一性羰基还原酶与甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达被引量：6
- 2008年
- 【目的】通过研究(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达,解决较高底物浓度下不对称转化反应的辅酶限制性问题。【方法】分别以近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)基因组为模板,采用PCR方法扩增得到(R)-专一性羰基还原酶基因(rcr)和甲酸脱氢酶基因(fdh),克隆到共表达载体pETDuet^(TM)-1中进行表达。共表达质粒pETDuet-rcr-fdh转化稀有密码子优化型菌株E.coli Rosetta,获得重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh。【结果】在30℃条件下,经1 mmol/L IPTG诱导表达8 h后,SDS-PAGE结果表明(R)-专一性羰基还原酶和甲酸脱氢酶均有明显的表达,其相对分子质量分别为37 kDa和40 kDa。以高浓度(6 g/L)2-羟基苯乙酮为底物时,0.1 g重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇,产物光学纯度为100%e.e.,产率为85.9%。与无甲酸脱氢酶参与辅酶再生循环的重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr相比,产物光学纯度和产率分别提高了1.3和2.7倍。【讨论】该重组菌的构建为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。
- 孙莹张荣珍徐岩
- 关键词：羰基还原酶甲酸脱氢酶共表达辅酶再生
- 生物法转化分离耦合制备γ-癸内酯被引量：8
- 2007年
- 研究通过添加树脂AB-8吸附转化产物以降低高浓度产物对Yarrowia lypolitica细胞的毒性,进而提高产量。确定了蓖麻油添加量25 g/L、树脂量7.5%、pH值7.5的最佳优化工艺,产物的最大比生成速率提高36%且达到最大值后降低较慢,有利于产物积累,56 h后总产量达到2.17 g/L,耦合工艺在提高产量的同时又能较好地实现产物的分离。
- 于伟徐岩喻晓蔚穆晓清
- 关键词：Γ-癸内酯树脂吸附
- (R)与(S)-羰基还原酶偶联一步法制备(S)-苯乙二醇被引量：2
- 2009年
- 【目的】通过(R)-和(S)-羰基还原酶在大肠杆菌中偶联,实现了一步法制备(S)-苯乙二醇的生物转化过程。【方法】将来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羰基还原酶基因(rcr)和(S)-羰基还原酶基因(scr)串联于共表达载体pETDuetTM-1上。重组质粒pETDuet-rcr-scr转化稀有密码子优化型菌株Escherichia coli Rosetta,获得酶偶联重组菌株E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-scr。当重组菌体培养至OD6000.6～0.8时,添加终浓度1mmol/L IPTG,30℃诱导蛋白表达10h。【结果】SDS-PAGE结果表明(R)-和(S)-羰基还原酶均明显表达,它们的相对分子质量分别为37kDa和30kDa。重组菌生物转化结果表明:在pH7.0的磷酸缓冲液中,添加5mmol/L Zn2+时,获得产物(S)-苯乙二醇,产物光学纯度为91.3%e.e.,产率为75.9%。【讨论】采用分子重组技术成功整合了两种氧化还原酶的催化功能,实现了(S)-苯乙二醇的一步法转化,为简化手性醇制备途径提供了一条崭新的思路。
- 张荣珍徐岩孙莹耿亚维
- 关键词：羰基还原酶生物转化
- 生物催化立体选择性氧化还原中存在问题及其发展策略被引量：8
- 2008年
- 以立体选择性氧化还原酶或其全细胞催化的不对称氧化还原反应已经成为转化光学活性手性醇及其他手性化合物的有效手段。然而,生物催化氧化还原反应体系存在着催化活性与专一性、反应体系与催化稳定性等生物催化剂所固有的局限性问题,而且,生物氧化还原反应必需辅酶及其再生问题也是限制该转化途径产业化应用的一个重要因素。围绕上述生物催化立体选择性氧化还原中存在的关键问题,现代分子生物技术及反应工程的不断突破和发展为改善生物催化立体选择性氧化还原在催化剂本身和反应工程方面的局限性提供了有效的发展策略,为其进一步大规模产业应用提供了发展基础。
- 聂尧徐岩
- 关键词：生物催化
- 双菌氧化还原耦联转化外消旋2-辛醇制备(R)-2-辛醇
- 2006年
- 建立了一种新的制备手性2-辛醇的方法——双菌氧化还原耦联转化外消旋2-辛醇制备(R)-2-辛醇。通过筛选得到了一株选择性氧化外消旋2-辛醇中(S)-2-辛醇的菌株CandidacylindraceaATCC14830,其产物的光学纯度e.e.>98%,(R)-2-辛醇的产率>46%。与报道的一株还原2-辛酮得到(R)-2-辛醇的菌株OenococcusoeniCECT4730氧化还原耦联,底物浓度可达40g/L,产物的e.e.>98%,产率>92%。
- 江娟徐岩穆晓清
- 关键词：手性化合物
- 芽胞杆菌(Bacillus sp.)YX-1耐有机溶剂葡萄糖脱氢酶的基因克隆与酶学性质被引量：4
- 2013年
- 【目的】从芽胞杆菌(Bacillus sp.)YX-1基因组中克隆出一种有机溶剂耐受型的葡萄糖脱氢酶基因,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,研究了重组蛋白的酶学性质。【方法】依据芽胞杆菌属中葡萄糖脱氢酶氨基酸序列的保守性,设计合理引物,钓取来源于Bacillus sp.YX-1的葡萄糖脱氢酶基因,构建诱导型表达载体pET28a-gdh,于大肠杆菌中进行表达。镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,考察了重组蛋白的酶学性质。【结果】葡萄糖脱氢酶基因全长为786 bp,编码261个氨基酸。酶学研究结果表明:该酶最适反应温度为45℃,最适pH值为8.0;具有良好的有机溶剂耐受性,于50%的辛烷、环己烷、癸烷中室温放置1 h后,酶活仍能保持90%以上;具有较宽的底物谱,对多种糖均具有一定的催化活性,其中催化D-葡萄糖的活力最高,产生还原型辅酶因子;对辅酶NADH和NADPH具有相似的依赖性,对NAD+和NADP+的催化比活分别为8.37 U/mg和8.62 U/mg。【结论】利用生物信息学成功地挖掘出Bacillus sp.YX-1一种耐有机溶剂的葡萄糖脱氢酶,为氧化还原酶在有机相反应中的的辅酶再生循环提供了新型的生物催化剂。
- 张波涛张荣珍王磊徐岩
- 关键词：葡萄糖脱氢酶辅酶再生有机溶剂耐受性底物特异性
