卫生部卫生公益性行业科研专项(200802173)
- 作品数：12 被引量：22H指数：3
- 相关作者：喻田魏义勇李科王海英喻守佳更多>>
- 相关机构：遵义医学院遵义医学院附属医院遵义市第一人民医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Nycodenz密度梯度离心法提取及纯化大鼠心肌线粒体被引量：4
- 2016年
- 目的建立一种利用Nycodenz密度梯度离心法提取组织线粒体的方法。方法传统离心方法得到粗提线粒体后,在Nycodenz密度梯度介质中超高速离心得到纯化线粒体,进一步在经改良的线粒体分离介质中重复离心2次,得到高纯度的线粒体。利用透射电镜和Western Blot检测线粒体纯度。结果使用Nycodenz密度梯度离心法和线粒体分离介质提纯的线粒体量多、纯度较高(COXⅣ含量纯化组:粗提组=220%±26%vs.160%±34%,P<0.05),且电镜照片显示结构完整。结论使用Nycodenz密度梯度离心法可获得高纯度且结构较完整的线粒体。
- 李科魏义勇刘云曹嵩刘兴奎王海英喻田
- 关键词：线粒体密度梯度离心法
- 二氮嗪后处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌线粒体蛋白质表达的影响被引量：1
- 2016年
- 目的观察二氮嗪(DZ)后处理对大鼠缺血/再灌注损伤心肌线粒体蛋白质表达的影响。方法将18只雄性SD大鼠随机分为3组各6只,麻醉后取心脏建立Langendorff离体心肌缺血/再灌注损伤模型;对照组仅持续灌注K-H液120 min,无缺血再灌注损伤;模型组、DZ组缺血前先灌注K-H液平衡20 min,灌注停跳液使全心缺血40 min后,模型组继续灌注K-H液60 min,DZ组先予50μmol/L二氮嗪5 min后灌注K-H液55 min。采用双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MAIDI-TOF MS)技术检测心肌线粒体中的蛋白质,记录表达差异在1.5倍以上的蛋白质。结果缺血再灌注末,与对照组相比,模型组、DZ组心肌线粒体中丙酮酸脱氢酶E1α亚基(PDHA1)、短链/支链脂酰辅酶A脱氢酶(ACADSB)、NADH脱氢酶Ⅰ10α亚基(NDUFA10)、rCG55630等蛋白质表达明显上调;与模型组比较,DZ组NDUFA10、rCG55630等蛋白质表达明显下调。结论缺血/再灌注损伤可上调心肌线粒体蛋白质PDHA1、ACADSB、NDUFA10和rCG55630表达,二氮嗪后处理可能通过下调NDUFA10和rCG55630等蛋白表达从而减轻心肌缺血/再灌注损伤。
- 张琳喻田任思宏黄建廷
- 关键词：心肌组织再灌注损伤二氮嗪蛋白组学
- 硫化氢后处理对大鼠心肌缺血再灌注时左心室收缩功能的影响被引量：1
- 2010年
- 目的 探讨硫化氢后处理对大鼠心肌缺血再灌注时左心室收缩功能的影响.方法 实验一成年雄性SD大鼠,体重200～250 g,采用Langendorff装置建立离体心脏灌注模型.取离体灌注模型制备成功的心脏40个,随机分为5组（n=8）：对照组（C组）、缺血再灌注组（IR组）和硫氢化钠1、10、100 μmol/L后处理组（SP1组、SP10组、SP100组）.平衡灌注20 min后,C组继续灌注K-H液100 min;IR组灌注ST.Thomas停跳液10 ml/kg后停灌40 min,恢复K-H液灌注60 min;SP1组、SP10组、SP100组全心缺血40 min,于再灌注前灌注含1、10、100 μmol/L硫氢化钠的K-H液2 min,然后恢复K-H液灌注60 min.于平衡灌注末和再灌注60 min时,记录左室发展压（LVDP）、左心室发展压最大上升速率（＋dp/dtmax）和左心室发展压最大下降速率（-dp/dtmax）.实验二成年雄性SD大鼠,体重200～250 g,分离心肌细胞,加入培养皿中,放入95%O2-5%CO2培养箱中培养4 h.取64皿细胞,随机分为4组（n=16）：对照组（C组）、缺氧复氧组（HR组）、硫化氢后处理组（SP组）和缺氧后处理组（HP组）.C组继续于95%O2-5%CO2培养箱中培养2 h;HR组于95%N3-5%CO2培养箱中缺氧1 h,然后于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h;SP组于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧1 h,加入硫氢化钠10μmol/L孵育2 min,然后于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h;HP组于95%N2-5%CO2培养箱中缺氧1 h,然后复氧3 min,缺氧3 min,重复3次,再于95%O2-5%CO2培养箱中复氧1 h.测定线粒体膜电位和F-肌动蛋白的表达.结果 实验一与C组比较,再灌注60 min时IR组LVDP和±dp/dp/dtmax降低（P＜0.05）,SP1组、SP10组和SP100组LVDP和±dp/dtmax差异无统计学意义（P＞0.05）;与IR组比较,SP1组、SP10组和SP100组LVDP和±dp/dtmax升高（P＜0.05）;SP1组、SP10组和SP100组间LVDP和±dp/dtmax比较差异无统计学意义（P＞0.05）.实验二与C组比较,HR组和HP组线粒体膜电位降低,HR组、SP组和HP组F-肌动蛋白表达上调（P＜0.05
- 程翅喻田刘兴奎邓胜利姚刚
- 关键词：硫化氢心肌再灌注损伤心脏功能试验
- 心肌线粒体蛋白质组学中的双向电泳及硝酸银染色方法的优化
- 2018年
- 线粒体是心肌氧化应激和钙超载损伤的重要场所,是调控缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IR)的重要细胞器[1-2]。利用心肌线粒体蛋白质组学找寻相关靶蛋白,再以这些靶蛋白为切入点进行研究,有助于进一步揭示IR的机制。然而,蛋白质组学中用到的双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技术复杂,对实验要求高。鉴于此,本研究通过反复实践,将2-DE技术及硝酸银染色方法进行优化,用于大鼠心肌线粒体蛋白质组学研究。
- 魏义勇李科刘云曹嵩王海英
- 关键词：蛋白质组学心肌线粒体染色方法双向电泳硝酸银ISCHEMIA
- 优化硝酸银染色在心肌线粒体蛋白双向电泳后凝胶染色中的应用
- 2018年
- 蛋白组学研究中双向电泳(2-DE)后的SDS-PAGE凝胶染色存在灵敏度和质谱兼容性问题。线粒体中存在大量微量蛋白,对于这类亚细胞器蛋白质2-DE后的凝胶染色,这两种特性显得尤为重要。经典的硝酸银染色虽灵敏度高,但之后的质谱鉴定兼容性欠佳。因此,该研究通过优化硝酸银染色方法观察大鼠心肌线粒体蛋白质2-DE后的凝胶染色效果,挖取部分蛋白质斑点酶解后行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定,验证优化硝酸银染色与质谱鉴定的兼容性。结果表明,优化后的硝酸银染色方法灵敏度高,与MALDI-TOF-MS兼容性好,是一种线粒体蛋白质2-DE后染色的理想方法。
- 魏义勇李科刘云喻守佳王海英喻田
- 关键词：线粒体蛋白组学双向电泳
- 吡那地尔后处理大鼠缺血再灌注损伤心肌线粒体的蛋白质组学研究被引量：10
- 2015年
- 目的:运用蛋白质组学研究方法探讨吡那地尔后处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用。方法:建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型,随机分为吡那地尔后处理组(Pina组)和缺血再灌注损伤组(I/R组),每组9只。提取心肌线粒体蛋白质行双向凝胶电泳,应用质谱鉴定差异大于2倍的蛋白质点。结果:Pina组与I/R组比较,共发现7个差异蛋白质:Pina组NADH脱氢酶1α亚复合体10亚基(NDUFA10)﹑NADH脱氢酶铁硫蛋白2(NDUFS2)和NADH脱氢酶黄素蛋白2(NDUFV2)表达低于I/R组;Pina组异柠檬酸脱氢酶α亚基(IDHA)和Δ3,5-Δ2,4-二烯酰辅酶A异构酶(ECH1)表达高于I/R组;另有2个蛋白质点均被鉴定为ATP合酶δ亚基,一个蛋白质点表达升高,而另一个表达降低。结论:吡那地尔后处理可能抑制了复合体Ⅰ的亚基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)代偿性增加,但促进了IDHA和ECH1表达并引发了ATP合酶δ亚基发生磷酸化,这些改变可能均与吡那地尔后处理保护心肌的作用有关。
- 魏义勇李科刘云刘兴奎王海英喻田
- 关键词：吡那地尔缺血再灌注损伤蛋白质组学后处理
- 考马斯亮蓝凝胶染色联合近红外成像用于双向电泳前的蛋白质定量被引量：2
- 2013年
- 双向电泳的蛋白质定量由于存在试剂兼容性的问题，常常需要使用GE或Bio-Rad公司专用的蛋白质定量试剂盒。这类试剂盒价格昂贵且实验操作繁琐，亟待建立一种准确、快速且廉价的双向电泳蛋白质样品的定量方法。不同浓度的蛋白质样品经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）产生的蛋白质条带，经考马斯亮蓝（CBB）染色后能被近红外光激发出不同强度的荧光。利用这一性质，以牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白质定量的标准品，使用0dyssey近红外荧光扫描成像系统绘制标准曲线用于双向电泳蛋白质样品的定量。实验结果表明，使用“700 channel”，在l～10μg的范围内，蛋白量与荧光强度表现出良好的线性和可重复性。因此，基于Odyssey近红外成像的考染凝胶定量的方法是一种精确快速可用于双向电泳蛋白质定量的方法。
- 曹嵩邓文文朱欣婷胡姗姗喻田刘云
- 关键词：蛋白定量考马斯亮蓝染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳双向电泳
- 缺血后处理心肌细胞线粒体比较蛋白质组学的研究被引量：1
- 2017年
- 目的以大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,利用蛋白质组学对纯化的大鼠心肌细胞线粒体进行分析和鉴定,探讨缺血后处理大鼠心肌细胞线粒体蛋白表达的变化。方法 24只大鼠随机分为正常组(Normal,Nor)、缺血再灌注损伤组(Control,Con)、缺血后处理组(ischemic postconditioning,IPO)、5-羟葵酸拮抗缺血后处理组(5-hydroxydecanoate,5-HD+IPO),利用Langendorff灌注装置构建各组大鼠离体心脏模型。以Nycodenz密度梯度离心法分离大鼠心肌线粒体,通过Western blot方法检测其纯度,提取各组线粒体蛋白,进行2D-DIGE分离,分析差异表达蛋白,进行MALDI-TOF-MS鉴定。结果与Nor组比较,Con组NADH脱氢酶亚基(NDUFA10)表达水平降低3.84倍;IPO和Con组比较:NDUFA10和琥珀酸脱氢酶-黄素蛋白(SDHA)的蛋白表达水平分别减少3.33倍和1.68倍。与IPO组比较,5-HD+IPO组的SDHA表达水平升高1.65倍。结论心肌缺血再灌注损伤降低了NDUFA10蛋白的活性,可能在缺血后处理线粒体NADH呼吸链稳定的维持过程中发挥作用,SDHA蛋白和线粒体敏感性K^+通道(mito KATP)可能同时在缺血后处理内源性保护机制中具有作用。
- 张琳周雯静黄建廷喻田
- 关键词：缺血后处理线粒体蛋白质组学质谱分析心肌保护
- 大鼠心肌线粒体蛋白质组学样本制备方法学的探讨
- 2018年
- 目的寻找心肌线粒体蛋白质组学研究中样本制备关键环节的可行性方案。方法分为组织匀浆组(TH组)、差数离心提取心肌线粒体组(CM组)及差数离心后再通过Nycodenz密度梯度离心法提纯线粒体组(PM组)。通过Western blot法检测各亚细胞器标志性蛋白的含量验证线粒体的纯度,提取CM组与PM组中的蛋白质行双向凝胶电泳(2-DE),观察硝酸银染色后CM组与PM组的凝胶图像,选取PM组中的部分蛋白质斑点酶解后质谱鉴定。结果本实验提纯的线粒体纯度较高;PM组蛋白质2-DE后凝胶银染图像较CM组更清晰,背景更佳;选取的部分蛋白质经鉴定均为线粒体蛋白。结论本实验为心肌线粒体蛋白质组学研究中的样本制备提供了较好的方法。
- 魏义勇刘云喻守佳王海英喻田
- 关键词：蛋白质组学心肌线粒体
- 缺血再灌注损伤大鼠心肌线粒体蛋白质组学的研究被引量：3
- 2017年
- 目的运用蛋白质组学的研究方法探讨心肌缺血再灌注损伤的机制。方法建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型,随机分为正常组(Nor组)和缺血再灌注损伤组(IR组),每组9只。提取心肌线粒体蛋白质行双向凝胶电泳,质谱鉴定差异大于2倍的蛋白质点。结果 Nor组和IR组比较,共发现4个差异蛋白质:其中NADH脱氢酶铁硫蛋白2(NDUFS2)表达上调,ATP合酶α亚基(ATPA)﹑电子传递黄素蛋白α亚基(ETFA)和细胞色素C1亚基2表达下调。结论ATPA﹑ETFA﹑细胞色素C1亚基2和NDUFS2可能与心肌缺血再灌注损伤有关。
- 魏义勇李科喻守佳喻田
- 关键词：缺血再灌注损伤线粒体蛋白质组学
