国家杰出青年科学基金(81101216)
- 作品数：4 被引量：3H指数：1
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- 结核分枝杆菌ClpC2蛋白的纯化、抗血清的制备及抗原性分析
- 2014年
- 目的:分别探索结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ClpC2蛋白和兔抗ClpC2多克隆抗体作为肺结核检测抗原或抗体的可行性。方法:诱导表达重组蛋白ClpC2(rClpC2);SDS-PAGE与Western blot鉴定rClpC2后利用亲和层析法进行纯化;纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔,Western blot检测兔抗血清的特异性;双向免疫扩散法与酶联免疫吸附法(ELISA)测定兔抗血清效价;rClpC2通过间接ELISA进行抗原性的初步检测,兔抗ClpC2多克隆抗体通过间接ELISA检测肺结核病人血清中ClpC2抗原。结果:rClpC2经SDS-PAGE分析,在相对分子质量46 kD处可见特异性条带;Western blot分析rClpC2可与MTB H37Rv株感染的小鼠血清发生抗原抗体反应;经Bandscan分析rClpC2约占菌体总蛋白的58.7%,纯化后rClpC2的纯度为88.5%;Western blot验证兔抗血清可与卡介苗(Bacillus calmette-guerin,BCG)的ClpC2蛋白发生抗原抗体反应;双向免疫扩散法测定兔抗血清效价为1∶32,ELISA法测定兔抗血清效价为1∶320 000;rClpC2在检测肺结核病人中的检出率为46%,检测敏感性为46%,特异性为90%;兔抗ClpC2多克隆抗体在检测肺结核病人中的检出率为40%,检测的敏感性为40%,特异性为90%。结论:成功纯化结核分枝杆菌ClpC2蛋白,制备特异性兔抗ClpC2多克隆抗体,为进一步研究ClpC2蛋白的生物功能、ClpC2作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性及兔抗ClpC2多克隆抗体生物学功能提供实验基础。
- 穆柳青李岱容张春燕樊宇何永林杨春
- 关键词：结核分枝杆菌
- 结核分枝杆菌Rv2460c基因的克隆,表达及编码产物的免疫特性分析被引量：1
- 2015年
- 目的:对结核分枝杆菌Rv2460c基因(编码Clp P2蛋白)进行克隆,表达,并评价其编码产物的免疫原性。方法:扩增结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)H37Rv的Rv2460c基因,构建重组质粒p ET32a(+)-Clp P2,用IPTG诱导表达,利用亲和层析法进行纯化。用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白Clp P2的表达和鉴定。用生物信息学对Mtb Clp P2的免疫原性分析和表位预测。酶联免疫吸附法(ELISA)测定兔和TB病人血清anti-Clp P2滴度。结果:重组Clp P2蛋白酶在大肠杆菌中以包涵体形式表达,经bandscan软件分析纯化蛋白的纯度为93%。生物信息学分析Mtb Clp P2蛋白具有多个优势B细胞表位和T细胞表位。ELISA法测定兔抗血清效价为1∶64 000;检测肺结核病人血清中anti-Clp P2抗体水平高于健康对照人群。结论:成功纯化了重组蛋白Clp P2和制备了特异性兔抗Clp P2多克隆抗体,实验和信息学均表明Mtb Clp P2蛋白酶有较强的免疫原性。
- 康月茜张春燕穆柳青卢楠杨春李岱容
- 关键词：结核分枝杆菌免疫原性
- 结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2基因原核表达质粒的构建及表达
- 2013年
- 目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2(ATP-dependent Clp regulatory subunit C2,ClpC2)基因的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增ClpC2基因,插入表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-ClpC2,经双酶切及测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,可与鼠抗组氨酸单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-ClpC2,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpC2蛋白的生物学功能奠定了基础。
- 穆柳青李岱容张春燕杨静冯鑫杨春
- 关键词：结核分枝杆菌原核细胞
- GLS3′-非编码区-荧光素酶报告质粒的构建及其活性鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的构建颗粒溶素基因3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)-荧光素酶报告质粒,检测颗粒溶素和微小RNA(miRNA)调控位点的关联性。方法将人工合成的GLS基因3’-UTR区序列,克隆至荧光素酶报告质粒pGL3-control;通过Targetscan5.1等软件预测可能与GLS基因3’-UTR作用的miRNA;将荧光素酶报告质粒和miRNA真核表达质粒共转染293T细胞,为防止脱靶效应,同时转染anti-mir-inhibitor和anti-mir-control,用双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果用Targetscan5.1软件、PicTar软件和miRBase数据库预测交叉结果显示,miRNA(mir)-218、mir-514、mir-185、mir-611均与GLS基因3’-UTR存在互补结合位点;构建的miRNA真核表达质粒和荧光素酶报告质粒经酶切及测序鉴定正确;2种质粒共转染293T细胞后,miRNA-218可使荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性降低75%左右(P<0.01);转染anti-mir-inhibitor后,荧光素酶的表达恢复到正常水平。结论成功构建了GLS基因3’-UTR荧光素酶报告质粒,通过检测荧光素酶活性,筛选出和GLS表达相关的miRNA片段即miRNA-218,为探讨miRNA调控GLS表达机制打下实验基础。
- 杨静杨春何永林徐蕾李岱容冯鑫秦国东
- 关键词：MIRNA
