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烟草花叶病毒南瓜分离物CP基因的克隆、序列分析及其原核表达被引量：13: 2010年; 为从分子水平鉴定山东聊城的一表现明显花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜病毒病的病原。采用RT-PCR的方法,用TMV外壳蛋白(CP)基因的特异引物,对该样品进行了检测,克隆到的基因序列进行分析,并使其在大肠杆菌中表达。结果表明,从该样品中扩增到了TMV的CP基因,说明该样品受到TMV的侵染,首次发现TMV自然侵染南瓜。对CP基因序列测定及分析表明,与GenBank上其他TMV分离物CP基因核苷酸序列的同源性为86.5%～99.0%,推导的氨基酸序列同源性为93.7%～99.4%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:32个TMV分离物可分为5个组,其中TMV-liaocheng与Nakron Pathom、Fujian、017等分离物属于Ⅳ组。TMV-liaocheng可能发生过重组。将TMV-liaocheng CP基因与原核表达载体pET-22b(+)连接,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS诱导表达出分子量约20kDa的融合蛋白,并用Ni2+-NTA His·Bind树脂纯化,纯化后的蛋白可直接用于制备特异性的抗血清,为准确、快速地检测TMV奠定了基础。; 刘金亮王凤婷魏毅潘洪玉张世宏; 关键词：南瓜烟草花叶病毒 CP基因原核表达

核盘菌交配型基因MAT-2的克隆,序列分析及原核表达: 2011年; 核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)有性生殖决定着菌核病的初侵染及流行程度,有性生殖过程中的交配型基因对该菌的性别控制和遗传进化起着决定性作用,为揭示核盘菌有性生殖的分子机制,本研究对核盘菌的交配型基因MAT-2进行了克隆、序列分析及其原核表达的研究。根据GenBank中核盘菌MAT-2基因(DQ159959)序列设计引物,提取该菌总RNA,采用Reverse Transcription-PCR(RT-PCR)的方法扩增交配型基因MAT-2,对其进行序列分析,构建其原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21中进行原核表达。以反转录产物为模板,扩增出1185 bp的MAT-2基因片段(命名为MAT-2-JL),通过测序及序列分析,结果表明,与GenBank中不同真菌的交配型基因核苷酸序列的同源性为26.6%～98.8%,推导的氨基酸序列同源性为12.0%～98.8%。根据完整的MAT-2基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:不同菌株的24个交配型基因可分为2组,其中MAT-2-JL与黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)和藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi)MAT-2等属于组Ⅰ。将MAT-2-JL基因与原核表达载体pET28a连接,在大肠杆菌BL21中诱导表达出分子量约48.2 kD的融合蛋白。; 陈婷婷孙庚刘金亮孙明洋胡瑞学张世宏潘洪玉; 关键词：核盘菌克隆原核表达

侵染南瓜的西瓜花叶病毒和黄瓜花叶病毒CP基因的克隆和序列分析被引量：8: 2010年; 为从分子水平鉴定山东聊城的一表现明显花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜病毒病的病原,采用RT-PCR的方法,用马铃薯Y病毒属病毒3′-末端序列的简并引物和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)外壳蛋白(CP)基因的特异引物,对该样品进行了检测,并对克隆到的基因序列进行分析。结果表明,该样品受西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)和CMV2种病毒的复合侵染,分别命名为WMV-liaocheng和CMV-liaocheng,与其他相应病毒分离物CP基因核苷酸序列的同源性分别为91.2%～98.0%和77.0%～97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为96.4%～98.5%和81.2%～99.1%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:18个WMV分离物可分为3组,其中WMV-liaocheng与HLJ、CHN及Habenaria等分离物表现出较近的亲缘关系,形成Ⅲ组;30个CMV分为2个亚组,其中CMV-liaocheng属于亚组I,CMV-liaocheng可能发生过重组。; 刘金亮王凤婷魏毅张世宏潘洪玉; 关键词：南瓜西瓜花叶病毒黄瓜花叶病毒复合侵染 CP基因

核盘菌子囊盘cDNA文库的构建、EST序列分析与SsMADS基因的筛选被引量：1: 2010年; 以核盘菌子囊盘为材料,应用SMART(Switch Mechanism at 5′end of RNA Transcript)技术,构建了高质量的核盘菌cDNA文库.涂平板测定和酶切反应鉴定表明,原始文库的滴度为4.11×105,重组率达97.3%.通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,共获得1800条核盘菌有效表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST).同源比对分析表明,844条独立基因代表了242个已知基因,其余602个EST为未知序列.这242个已知基因大致可以分为3类:78个可归属于生物学过程,97个可归属于分子功能,67个可归属于细胞组分.其中,在97个分子功能基因中筛选到1个与MADS-box具有较高同源性的基因(SsMADS),推测可能与核盘菌的有性生殖过程有关.; 刘金亮郭艳梅郑明张世宏潘洪玉; 关键词：核盘菌子囊盘 CDNA文库 EST序列

侵染辣椒的黄瓜花叶病毒CP基因的序列分析、原核表达及抗血清制备被引量：3: 2010年; 从吉林长春感病辣椒上获得一黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物(CMV-CC),根据GenBank中已登录的CMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法克隆到了长度为657 bp的目的片段。序列分析表明,CMV-CC与CMVI组各分离物核苷酸同源性为93.2%-97.9%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:38个CMV分离物可分为3个组,CMV-CC属于CMV的IB亚组。将CMV-CC CP基因与原核表达载体pET-22b(+)连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达出分子量约27 kD的融合蛋白。表达的融合蛋白经树脂纯化后免疫家兔制备了抗血清。用间接ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting分析表明制备的抗血清对CP有高度特异性,为准确、快速地检测CMV奠定了基础。; 刘金亮王凤婷侯春喜魏毅张世宏潘洪玉; 关键词：黄瓜花叶病毒辣椒 CP基因原核表达抗血清制备

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