国家高技术研究发展计划(2007AA02Z153)
- 作品数：10 被引量：26H指数：3
- 相关作者：胡薇徐斌冯正鞠川卢艳更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心华东理工大学复旦大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家科技重大专项国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 日本血吸虫童虫cDNA文库免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定被引量：5
- 2009年
- 用日本血吸虫感染14d的小鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,将获得的7个阳性克隆进行核苷酸序列同源性分析,结果显示其中一个克隆所测序列与日本血吸虫HSP70有很高的同源性(分值score=650),另有2个克隆所测序列分别与已报道的日本血吸虫FABP(score=229)和含锌指结构的CDGSH型蛋白样蛋白(score=246)明显同源,其余4个未找到已知的同源序列,为新基因。4个新基因序列已被GenBank接受(登录号为EU121231、202646、202647和202648)。
- 段新伟傅颖慧卢艳黄成玉鞠川徐斌许学年冯正胡薇
- 关键词：日本血吸虫童虫CDNA文库免疫筛选
- 日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫筛选和阳性克隆的鉴定被引量：5
- 2012年
- 目的寻找可用于日本血吸虫病诊断或疗效考核的抗原分子。方法在安徽省安庆市某现场,采集经粪检(Kato-Katz法,2送6检)日本血吸虫卵阳性的10份患者血样,患者年龄13～64岁,EPG为4～172;并收集该10例患者经吡喹酮(60 mg/kg×2 d)治疗6个月后的血样,将吡喹酮治疗前和治疗后的血清各10份分别混合,分别筛选虫卵cDNA文库,将所获阳性克隆分类,测定阳性克隆插入片段的DNA序列,经BLAST程序分析同源性,并利用在线的生物信息学软件预测阳性克隆基因编码蛋白的结构和功能。结果初次筛选共获得75个阳性克隆,其中46个阳性克隆吡喹酮治疗前和治疗后的日本血吸虫病患者血清反应一致(为Ⅰ类),21个阳性克隆吡喹酮治疗前的血清强于治疗后的(为Ⅱ类);8个阳性克隆吡喹酮治疗后的血清强于治疗前的(为Ⅲ类)。结合反应强度、分类和插入片段的大小选择了14个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,多数阳性克隆插入片段均属于虫卵毛蚴抗原家族,1个阳性克隆的插入片段与含EF-hand结构域的钙结合蛋白具有一定的同源性(分值=143),1个阳性克隆的插入片段与应激反应组分1前体具有较高的同源性(分值=487),其余阳性克隆的插入片段仅与假定蛋白有一定的同源性,蛋白功能无明确注释。结论用吡喹酮治疗前后的日本血吸虫病患者血清筛选虫卵cDNA文库,获得的29个阳性克隆在吡喹酮治疗前后有差异。
- 卢艳徐斌鞠川莫筱瑾陈绅波冯正王小宁胡薇
- 关键词：日本血吸虫虫卵CDNA文库免疫筛选疗效考核
- 日本血吸虫内皮分化相关因子-1基因的克隆、表达及鉴定被引量：1
- 2010年
- 目的克隆、表达日本血吸虫内皮分化相关因子(endothelial differentiation-related factor)-1编码基因(SjEDF-1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的特异性表达情况。方法制备日本血吸虫卵、尾蚴、童虫和成虫等各发育阶段的总RNA,采用RT-PCR方法 ,以管家基因SjActin为内参,根据SjEDF-1基因全长编码序列(GenBank登录号为AY336498)的开放阅读框设计引物进行RT-PCR扩增,分析日本血吸虫各发育阶段SjEDF-1基因mRNA表达情况。将SjEDF-1基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,以纯化的重组SjEDF-1蛋白免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性及该蛋白在日本血吸虫各发育阶段的表达差异。结果 RT-PCR结果显示,除尾蚴外,在虫卵、童虫、雄虫和雌虫期均扩增出约405bp的片段。含重组质粒SjEDF-1/pET-28a的转化子细菌,经IPTG诱导,获得以不可溶的包涵体形式存在的重组蛋白,其相对分子质量(Mr)为20000,与预测的融合蛋白大小相符。Western blotting分析结果显示,纯化后的重组蛋白SjEDF-1可被日本血吸虫感染兔血清识别,在血吸虫童虫和成虫阶段检测到目的蛋白的表达。结论重组蛋白SjEDF-1具有较强的免疫原性,在血吸虫童虫和成虫期检测到该蛋白特异表达。
- 邓王平冯正徐斌孔娟胡薇
- 关键词：日本血吸虫免疫原性
- 日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白 基因的克隆 表达及鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白(SjTollip)基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性。结果构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别。虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低。免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高。结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。
- 王晓娜徐斌冯正王小宁胡薇
- 关键词：日本血吸虫克隆
- 血吸虫体被的结构功能及其蛋白质组研究被引量：8
- 2008年
- 血吸虫体表由一层合抱体细胞组成,称为体被。体被在血吸虫的营养吸收和免疫逃避等方面发挥重要作用,也被认为是诊断、疫苗和药物的潜在靶点。近年来兴起的体被蛋白质组研究,迄今已发现和鉴定了一大批体被蛋白,这将为血吸虫病的预防控制提供重要线索。
- 钱门宝胡薇
- 关键词：血吸虫蛋白质组
- 日本血吸虫含EF-手型结构域钙结合蛋白的克隆表达与免疫诊断分析被引量：2
- 2012年
- 目的克隆和表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)含EF-手型(EF-hand)结构域钙结合蛋白(SjEFCAB)的编码基因,纯化表达产物,鉴定重组蛋白的反应原性,初步评价其用于日本血吸虫病诊断的价值。方法以日本血吸虫虫卵cDNA文库中免疫筛选所获阳性克隆删除环化后的pBluescript-SjEFCAB质粒为模板,扩增SjEFCAB基因,将目的基因片段与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签亲和层析法纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其反应原性。以SjEFCAB为包被抗原,采用间接ELISA方法检测日本血吸虫病(78份)、华支睾吸虫病(5份)、猪囊尾蚴病(10份)、卫氏并殖吸虫病(6份)和旋毛虫病(9份)患者血清,以及健康人血清(50份),评价该重组蛋白的免疫学诊断效果。结果构建了重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB,并在E.coli BL21中高效表达,经亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白SjEFCAB。Western blotting分析结果显示,重组蛋白SjEFCAB能被感染兔血清和血吸虫病患者血清所识别,在相对分子质量(Mr)约为8 200处出现条带。间接ELISA检测日本血吸虫病患者血清的敏感性为82.1%(64/78),特异性为95.0%(76/80)。与华支睾吸虫病患者、猪囊尾蚴病患者和旋毛虫病患者血清的交叉反应分别为1/5、1/10和1/9,与卫氏并殖吸虫病患者血清无交叉反应(0/6)。结论日本血吸虫SjEFCAB重组抗原具有较高的免疫学诊断价值。
- 卢艳徐斌鞠川莫筱瑾陈绅波冯正王小宁胡薇徐斌
- 关键词：日本血吸虫免疫诊断
- 日本血吸虫尼克酰胺磷酸核糖转移酶的生物信息学分析
- 2011年
- 目的对日本血吸虫尼克酰胺磷酸核糖转移酶(SjNAMPT)基因序列及蛋白序列进行生物信息学分析,为该基因的克隆表达和开发应用奠定基础。方法利用Internet在线分析程序和相关工具软件分析SjNAMPT基因的开放阅读框,分析基因编码蛋白的理化性质、结构域,并预测其空间结构和功能。结果 SjNAMPT蛋白由179个氨基酸组成,分子量为19.63kDa,理论等电点为7.64,为稳定性蛋白,无跨膜区和螺旋卷曲结构,不含有信号肽,含有多个磷酸化位点,该蛋白属于磷酸核糖转移酶保守结构域家族,亚细胞定位于细胞质,二级结构以无规卷曲为主,SjNAMPT蛋白序列与其他物种同种蛋白序列相似性较低。结论 SjNAMPT蛋白为日本血吸虫特异性蛋白,具有一定酶活性,可能与日本血吸虫嘌呤代谢和糖代谢有关,值得进一步研究。
- 葛军陈红根胡薇
- 关键词：日本血吸虫生物信息学疫苗
- 新的具有高度多态性的日本血吸虫微卫星位点的鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的从基因组序列中选择和设定新的、可用于研究日本血吸虫多态性的微卫星位点。方法672个日本血吸虫标本取自安徽、江西、湖南、湖北和四川等5省的7个流行区现场。根据日本血吸虫基因组数据库中的初始数据设计引物,对标本的17个全新的日本血吸虫微卫星位点进行分析。用GenMapper4.0软件(Applied Biosystems)进行初始数据处理,用GenClone1.0软件计算种群内各标本的遗传距离;用GenAlEx6软件统计等位基因的变化;用GenClone1.0软件计算种群内各标本的遗传距离;用UPGMA谱系图分析种群间遗传距离。结果17个微卫星位点均呈现多态性。对江西都昌种群的这17个位点进行分析,标本之间的遗传距离大多为25～32,显示江西都昌种群内各个标本之间的遗传差异明显。对7个地区种群分析的结果显示种群间的差异较为明显。类平均法系统聚类分析(UPGMA)谱系图显示,江西都昌、安徽铜陵、湖北沙市和湖南常德的种群同为一簇,其遗传距离为0.0178～0.0363;安徽贵池和湖南岳阳的为另外一簇,其遗传距离为0.0247;而四川西昌单独为一簇,与其他两簇的遗传距离为0.0192～0.0693。结论选择的17个微卫星位点可作为研究日本血吸虫种群遗传学的有效标记,并揭示中国大陆该虫种存在着复杂的遗传变异。
- 殷明波朱根凤张祥林徐斌莫筱瑾孙胜强王升跃David Blair胡薇冯正
- 关键词：日本血吸虫微卫星多态性
- 日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆、表达及虫期表达差异分析被引量：3
- 2011年
- 目的克隆和表达日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因1(SjAPRT1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的转录和蛋白表达情况。方法根据SjAPRT1基因序列(GenBank登录号为AAW24796)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,分析其在日本血吸虫各发育阶段转录本差异。将目的基因亚克隆至载体pET28a(+),转化至大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析纯化结果。纯化的蛋白SjAPRT1免疫新西兰白兔制备免疫兔血清,蛋白质印迹(West-ern blotting)分析其免疫反应性及其在日本血吸虫不同发育阶段表达的差异。结果在虫卵、尾蚴、童虫和成虫期均检测到SjAPRT1转录本(561 bp),获得了重组SjAPRT1蛋白。Western blotting分析表明,纯化的重组蛋白SjAPRT1可被日本血吸虫感染兔血清识别,虫卵、童虫和成虫粗抗原可被SjAPRT1免疫兔血清识别,在Mr 25 000处有特异性条带。结论日本血吸虫SjAPRT1蛋白在虫卵、童虫和成虫各期均有表达,并具有一定的免疫反应性。
- 孔娟冯正徐斌邓王平杨忠胡薇
- 关键词：日本血吸虫免疫反应性
- 日本血吸虫核糖体蛋白SjRibosom al_L18a及其B细胞表位的筛选和评价
- 2013年
- 目的筛选获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核糖体蛋白(SjRibosomal_L18a)编码基因,预测其B细胞表位。克隆、表达重组蛋白SjRibosomal_L18a,并比较分析其与合成的B细胞表位的潜在诊断价值。方法利用B细胞表位预测软件筛选日本血吸虫蛋白质序列,获取函数打分值较高且抗原表位片段多的免疫原性蛋白,合成B细胞表位片段。生物信息学方法分析免疫原性蛋白基因及其编码蛋白的相对分子质量(M r)、等电点、亲水性、信号肽、跨膜区和功能结构域等理化性质。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因,分析各虫期转录本丰度。将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a中,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标记亲和层析法纯化重组蛋白。ELISA法比较分析重组蛋白和合成的B细胞表位的潜在诊断价值。结果预测软件筛选出免疫原性核糖体蛋白SjRibosomal_L18a以及2个B细胞表位(P1和P2)。SjRibosomal_L18a基因开放阅读框(ORF)由531个碱基组成,编码176个氨基酸,不含跨膜区和信号肽,为M r20 741,等电点为11.12。RT-PCR结果显示,各虫期均检测到SjRibosomal_L18a的转录本,且转录水平均较高。成功构建重组表达质粒SjRibosomal_L18a/pET-28a,诱导表达获得包涵体形式的重组蛋白,约为M r26 069。ELISA检测结果显示,重组蛋白、P1和P2检测15份慢性血吸虫病患者血清和15份健康人血清的敏感性和特异性分别为53.3%(8/15)和100%(15/15)、60%(9/15)和100%(15/15)、73.3%(11/15)和100%(15/15)。结论获得重组蛋白SjRibosomal_L18a及其免疫原性较高的表位片段P1、P2,P1和P2用于血清诊断的敏感性均高于重组蛋白。
- 魏刚刚徐斌鞠川胡薇
- 关键词：日本血吸虫B细胞表位核糖体蛋白
