江苏省医学重点人才培养基金(RC2007080)
- 作品数：8 被引量：18H指数：4
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- 不同质量浓度粒巨噬细胞集落刺激因子对Lewis大鼠骨髓源性树突状细胞诱导分化的影响被引量：5
- 2009年
- 背景：体内成熟和不成熟树突状细胞（dendritic cells,DC）数量极少,仅占外周血单核细胞的1%,占脾细胞的0.2%-0.5%,几乎不能直接从体内分离出大量的纯化的DC,要获得足够的DC,只有依靠体外培养增殖。目的：以不同剂量粒巨噬细胞集落刺激因子诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,拟建立合适的大鼠骨髓源性未成熟DC的培养方法。设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-06/2008-05在苏州大学附属第一医院临床免疫学实验室和附属儿童医院骨科实验室完成。材料：雄性SPF级Lewis大鼠用于培养骨髓源性DC,雄性SPF级Brown Norway大鼠用于混合淋巴细胞反应实验。方法：采用密度梯度离心法从Lewis大鼠股骨和胫骨获取骨髓源性单个核细胞,分别以2.5,5,10,20μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子和5μg/L白细胞介素4诱导分化获得大鼠骨髓源性DC,采用黏附法纯化DC。主要观察指标：以流式细胞仪分析DC表型。混合淋巴细胞反应中以Lewis大鼠DC作为刺激细胞,以Brown Norway大鼠脾脏T细胞作为反应细胞,检测其刺激同种T细胞增殖能力。ELISA测定分泌细胞上清液中白细胞介素12、干扰素水平。结果：随粒巨噬细胞集落刺激因子质量浓度的增高,诱导的细胞获得率逐渐升高,但DC比例逐渐下降。CD86、MHC-II表达阳性率随培养时间延长逐渐增加。培养第5,7天,DC不能有效刺激同种异体T细胞的增殖反应,培养第13天,DC刺激同种异体T细胞的增殖反应能力明显增强（P〈0.01）。培养7d以后,DC上清液中白细胞介素12水平明显增高（P〈0.01）,脂多糖刺激以后升高更加明显（P〈0.01）。脂多糖刺激后DC表型MHCII、CD86表达明显增加,白细胞介素12分泌增加,刺激同种T细胞增殖能力轻度增强。结论：5μg/L粒巨噬细胞集落刺激因子为诱导大鼠骨髓源性未成熟DC的最佳剂量,培养9d可以获得足够数量和纯度的未成熟DC。
- 樊彩斌温端改欧阳骏侯建全严春寅张学光张亚
- 关键词：树突状细胞骨髓白细胞介素4
- 转染IκB激酶2的显性负性突变体的受者未成熟树突状细胞诱导产生的CD4＋CD25-T细胞致耐受特性被引量：1
- 2012年
- 目的探讨体外转染抑制性蛋白IKB激酶2的显性负性突变体（IKK2dn）基因的受者大鼠未成熟树突状细胞（imDC）诱导产生的CD4±CD25-T细胞致耐受作用的特性及机制。方法将含IKK2dn基因的腺病毒载体按1：200的感染复数（200MOI）体外转染受者Lewis大鼠骨髓源性imDC，2d后负载供者BN大鼠抗原，48h后与受者大鼠T细胞初次混合淋巴细胞反应（MLR），72h后免疫磁珠法分离筛选混合淋巴细胞反应（MLR）中诱导产生的CD4±CD25-T细胞，将获得的CD4±CD25-T细胞与受者大鼠T细胞再次MLR72h，检测其对T细胞增殖反应的影响，酶联免疫吸附试验（ELISA）测定MLR上清中白细胞介素（IL）-2、IL-10、转化生长因子（TGF）-p和干扰素（IFN）-1的水平。结果Westernblot结果显示，转染IKK2dn基因的imDC稳定、高效表达IKK2dn。转染IKK2dn受者imDC诱导产生的CD4＋T细胞低表达CD25（18．50±1．40）％，与未转染组（72．20±3．30）％及转染空载体组（63．70±1．80）％比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。转染IKK2dn诱导产生的CD4＋CD25-T细胞能抑制异种抗原刺激引起的受者T细胞的增殖反应（0．044±0．006），与转染空载体所诱导产生的CD4＋T细胞比较（0．419±0．014），差异有统计学意义（P〈0．05）。MLR中高比例的CD4＋CD25-T细胞能够明显抑制受者T细胞的增殖反应（0．044±0．006），与低比例组比较（0．106±0．006），差异有统计学意义（P〈0．05），且CD4＋CD25-T细胞介导的MLR上清液中IL-10、TGF—β水平明显升高（P〈0．05），IL-2、IFN-γ水平明显降低（P〈0．05）。结论转染IKK2dn基因并负载供者抗原的受者imDC可以诱导受者T细胞产生CD4＋CD25-T细胞，此种CD4＋CD25-T细胞能够引起受者T细胞针对供者抗原的特异性低反应，具有诱导免疫耐受的作用。
- 杜科霖樊彩斌温端改侯建全欧阳骏张东兴
- 关键词：树突状细胞淋巴细胞反应CD4
- 腺病毒介导的IL-24表达对PC-3人前列腺癌细胞体内外抑癌效应被引量：3
- 2010年
- 目的:研究腺病毒介导的IL-24基因表达对前列腺癌细胞体内外的抑癌效应及分子机制。方法:将扩增的Ad-IL-24感染PC-3细胞,用RT-PCR和Western blot法检测IL-24基因在PC-3细胞中的表达;MTT法检测IL-24基因表达对PC-3细胞的生长影响;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡变化;RT-PCR法检测IL-24基因的表达对PC-3细胞中的Bcl-2、Bax、p53和Caspase3凋亡相关基因表达的影响。用Ad-IL-24在裸鼠PC-3移植瘤的瘤体内注射治疗,通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、CD34等与细胞凋亡和血管形成相关因子的表达。结果:IL-24基因在PC-3细胞中成功表达,对PC-3细胞增殖有明显抑制作用,可上凋p53、Bax、Caspase-3基因和下凋Bcl-2基因表达,进而诱导细胞凋亡。Ad-IL-24能显著抑制裸鼠前列腺癌移植瘤生长,瘤重的抑制率可达54%;免疫组化结果显示Ad-IL-24不仅能明显上调Bax和Caspase-3基因和下调Bcl-2基因表达,而且能引起与血管形成标记基因CD34表达水平下降。结论:腺病毒介导的IL-24基因表达在体内外可明显抑制PC-3细胞的生长,诱导其凋亡。其机制可能与上凋P53、Bax、Caspase-3基因和下凋Bcl-2和CD34基因表达水平有关。
- 张治国杨吉成杨慧翠盛伟华谢宇锋龙建华丁翔欧阳骏
- 关键词：IL-24基因前列腺癌肿瘤抑制
- IKK2dn体外转染对大鼠树突状细胞成熟度的影响被引量：6
- 2009年
- 目的:探讨腺病毒介导IKK2dn基因(Adv-IKK2dn)体外转染大鼠树突状细胞(DCs)对其生物学行为的影响。方法:将含有IKK2dn基因的腺病毒载体转染大鼠骨髓源性DCs,获得稳定高表达IKK2dn的DCs。流式细胞术(FCM)分析转染IKK2dn基因DCs的表型变化,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激同种T细胞增殖的能力,ELISA测定MLR上清IL-10和IFN-γ水平。结果:Westernblot结果显示,转染pAdxsi-GFP-IKK2dn病毒质粒的DCs稳定表达IKK2dn。转染IKK2dn基因的DCs与未转基因的DCs相比,表面CD86和MHC-II的表达水平无显著差异。和负载BN大鼠抗原的未转染IKK2dn的DCs相比,转染IKK2dn并负载BN抗原的DCs刺激同种T细胞增殖能力显著下降(P<0.01),MLR上清中IL-10水平升高(P<0.01),而IFN-γ水平降低(P<0.01)。结论:IKK2dn基因的转染能使DCs维持于未成熟状态。同时,负载BN抗原的转IKK2dn基因的DCs可以抑制同种T细胞增殖反应,为诱导体内免疫耐受提供了实验依据。
- 欧阳骏樊一笋樊彩斌温端改侯建全严春寅张学光
- 关键词：树突状细胞混合淋巴细胞反应
- 编码人IKK2dn重组腺病毒载体的构建及表达验证被引量：1
- 2010年
- 目的构建含有人IKK2dn基因的重组腺病毒载体,为转染未成熟树突状细胞(DC)诱导免疫耐受研究奠定基础。方法从质粒pACCMVPLPASR(+)-IKK2dn中酶切出IKK2dn基因,并插入pShuttle-CMV-GFP(-)TEMP载体中构建成腺病毒穿梭质粒,KpnI/HindⅢ酶切鉴定。将pShuttle-CMV-GFP(-)TEMP-IKK2dn转移到pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-IKK2dn病毒质粒,XhoI酶切后鉴定。将鉴定正确的质粒用脂质体法转染人胚肾细胞株HEK293细胞,包装成重组病毒颗粒;并在HEK293细胞中反复扩增并纯化,根据报告基因GFP测定病毒滴度。转染宫颈癌细胞株HeLa细胞后采用RT-PCR检测目的基因的表达。结果经酶切和RT-PCR鉴定,得到预期的1060bp条带,证实成功构建了携带IKK2dn基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度(2×1011PFU/ml)的重组腺病毒。结论成功构建了含IKK2dn-cDNA的重组腺病毒,为进一步研究用IKK2dn基因修饰DC诱导免疫耐受等研究奠定了基础。
- 樊彩斌温端改欧阳骏农绍军侯建全严春寅浦金贤张学光
- 关键词：腺病毒载体树突状细胞
- 转染IKK2dn的受者树突状细胞回输延长同种异体肾移植大鼠的存活时间被引量：4
- 2010年
- 目的 探讨IKK2dn基因转染并负载供者抗原的受者未成熟树突状细胞（imDC）延长同种异体肾移植大鼠的存活时间及其机制。方法获取和培养Lewis大鼠骨髓源性DC，转染IKK2dn并负载BN大鼠可溶性抗原进行体外实验，检测CD86和主要组织相容性复合物（MHC）II的表达及DC刺激T淋巴细胞增殖的能力。。肾移植受者为Lewis大鼠，用随即数字表法分DC组、空转染组、转染组、对照组，术前7d分别输注1×10^7个DC、Adv-0-DC、负载BN抗原的Adv-IKK2dn-DC和等量生理盐水，供者均为BN大鼠，另设第i方供者组，术前处理同转染组，供者为Wistar大鼠。移植后检测各组受者T淋巴细胞的增殖能力及血清白细胞介素2（IL-2）和γ干扰素（IFN-γ）的表达水平，观察各组大鼠的存活时间和发生排斥反应情况。结果DC的体外实验结果显示：与转染IKK2dn前相比，转染后DC仍能低水平表达CD86和MHCⅡ，负载供者抗原后CD86和MHCⅡ表达均增加，而转染IKK2dn后再负载供者抗原，CD86和MHCⅡ的表达未发生明显变化；DC负载供者抗原后，刺激T淋巴细胞增殖的能力明显增强（P〈0．05），而转染IKK2dn并负载供者抗原后不能有效刺激T淋巴细胞增殖。肾移植术后的检测结果显示：转染组T淋巴细胞的增殖能力明显低于其他4组（P〈0．05或P〈0．01），血清ID2和IFN-γ水平也显著降低。转染组移植肾存活时间为（26．8±1．76）d，较其他各组显著延长（P〈0．01），并且转染组发生排斥反应的病理级别较低，病理学观察仅见间质少量炎症细胞浸润，肾小球和肾小管基本正常。结论IKK2dn基因转染并负载供者抗原的受者imDC回输可以延长同种异体肾移植大鼠存活时间，其机制可能与降低DC共刺激分子表达、抑制TH1细胞因子产生有关。
- 欧阳骏樊彩斌温端改侯建全严春寅张学光
- 关键词：树突细胞
- 腺病毒介导的ING4基因对人膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制被引量：7
- 2010年
- 目的 探讨腺病毒介导的人生长抑制因子4（ING4）基因对人膀胱移行细胞癌T24细胞体外抑癌效应及其分子机制.方法 将含ING4的重组腺病毒（Ad-ING4）转染T24细胞,以空载体组、未转染组细胞作对照.应用半定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹法检测各组ING4基因及蛋白质在T24细胞中的表达 四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测各组T24细胞生长情况 流式细胞术（FCM）和Hochest 33258染色法检测各组T24细胞凋亡变化 半定量RT-PCR法检测各组细胞中凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病基因-2（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x（Bax）、p53、缺氧诱导因子（HIF）1α和半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达 Western印迹法检测各组细胞中caspase-3蛋白的表达.结果 腺病毒介导的ING4基因在T24细胞中成功表达,能明显诱导T24细胞凋亡,其凋亡率可达17.2%±4.1%,高于空载体组（4.7%±1.2%）和未转染组（4.8%±1.2%,P〈0.05） 外源性ING4基因可引起T24细胞中p53、Bax基因表达上凋（1.40±0.11比0.27±0.04,1.50±0.12比0.60±0.05）和Bcl-2、HIF-1α基因表达下凋（0.19±0.02比1.20±0.08,0.33±0.03比0.98±0.06,均P〈0.05）,并促进caspase-3活化.结论 腺病毒介导的ING4基因在体外可通过上凋p53、Bax/Bcl-2基因和下凋HIF-1α基因表达,导致caspase-3的活化而抑制人膀胱移行细胞癌T24细胞的生长,并诱导其凋亡.
- 张治国欧阳骏韩从辉杨吉成杨慧翠龙建华丁翔
- 关键词：膀胱肿瘤细胞凋亡
- Ad-ING4-IL-24双基因共表达腺病毒对前列腺癌细胞株PC3体内外抑癌增效作用被引量：1
- 2010年
- 目的 观察肿瘤生长抑制因子4（ING4）和白细胞介素-24（IL-24）双基因共表达腺病毒载体对PC3人前列腺癌细胞体内外抑癌增效作用.方法 应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法检测ING4和IL-24在PC3细胞中的表达;噻唑蓝（MTT）比色法和流式细胞术（FCM）检测双基因对PC3细胞的生长抑制和凋亡效应;半定量RT-PCR法和Western blot法检测双基因的表达对PC3细胞中的bcl-2、bax、p53和Caspase-3凋亡相关基因表达的影响.在前列腺癌的裸鼠移植瘤动物模型上,检测Ad-ING4-IL-24对移植瘤生长的抑制作用,并通过免疫组织化学法检测bcl-2、bax、Caspase-3、CD34等相关因子的表达.结果腺病毒介导的ING4和IL-24双基因在PC3细胞中成功表达,对PC3细胞增殖具有抑癌增效功能,可引起p53、bax、Caspase-3基因表达上调和bcl-2基因表达下凋,诱导细胞凋亡.Ad-ING4-IL-24能显著抑制PC3裸鼠前列腺癌移植瘤生长,瘤重的抑制率可达74%,免疫组织化学结果显示Ad-ING4-IL-24能明显上调bax和Caspase-3的表达和下调bcl-2和CD34基因表达.结论 Ad-ING4-IL-24在体内外均可明显抑制PC3细胞的生长,诱导其凋亡,具有抑癌增效功能.其机制可能是通过上凋p53、bax、Caspase-3基因和下凋bcl-2和CD34基因表达水平.
- 张治国欧阳骏杨吉成韩从辉丁翔
- 关键词：ING4IL-24前列腺癌
