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Radixin定点突变过表达对HepG2细胞膜转运蛋白Bsep的影响被引量：2: 2014年; 目的构建pcDNA3.1-RDX定点突变真核过表达质粒,研究其在胆汁淤积时对HepG2细胞膜转运蛋白胆盐输出泵(bile salt export pump,Bsep)定位表达的影响。方法从含有RDX野生型质粒中,利用PCR方法钓取RDX野生型基因片段并以野生型为基础进行定点突变,PCR扩增后转入pcDNA3.1载体,其产物转化DH-5α感受态细胞。对长出的单克隆进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确即为构建成功的目的质粒。将目的质粒转染HepG2细胞,经G418筛选构建稳转细胞株。提取各株细胞的总蛋白,检测磷酸化RDX是否影响HepG2细胞膜上转运蛋白Bsep的表达。结果 PCR和测序结果均证实pcDNA3.1-RDX WT、pcDNA3.1-RDX T564D、pcDNA3.1-RDX T564A过表达载体构建成功。蛋白免疫印迹表明,与转染pcDNA-3.1-RDX-WT的HepG2相比,转染pcDNA-3.1-T564D的HepG2的Bsep膜蛋白表达量显著增加(P<0.05),而转染pcDNA-3.1-T564A的HepG2的Bsep膜蛋白表达量有所下降(P>0.05)。结论成功构建了pcDNA3.1-RDX WT、pcDNA3.1-RDX T564D、pcDNA3.1-RDX T564A过表达载体,并证实RDX的磷酸化能增强HepG2细胞膜上Bsep的表达。; 封欣婵柴进程英陈文生; 关键词：PCDNA3

川西獐牙菜醇提物上调HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、核转录因子SP1及核受体CPF、PXR表达被引量：6: 2014年; 目的体外培养HepG2细胞观察川西獐牙菜醇提物(Swertia mussitii Franch)对多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3,MRP3)、核转录因子SP1(specificity protein 1 transcription factor,SP1)及核受体孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)、CYP7A启动子结合因子(CYP7A promoter-binding factor,CPF)表达的影响。方法用MTT比色法检测川西獐牙菜醇提物的最佳作用浓度,再分别于0、12、24、48、72h刺激HepG2细胞,抽提细胞的RNA、总蛋白和核蛋白,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测膜转运蛋白MRP3、转录因子SP1及核受体PXR、CPF在转录与蛋白水平的表达变化。每个时间点设立阴性对照DMSO组和阳性对照熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)组。结果川西獐牙菜醇提物可显著诱导HepG2细胞膜转运蛋白MRP3的mRNA和蛋白水平的高表达,其作用强于UDCA(P<0.05)。川西獐牙菜醇提物也可明显上调核转录因子SP1及核受体PXR的mRNA和蛋白表达水平,作用强于UDCA。对CPF表达的上调作用与UDCA相当(P<0.05)。结论川西獐牙菜醇提物可刺激HepG2细胞膜转运蛋白MRP3上调,且有可能是通过核转录因子SP1及核受体PXR、CPF上调其表达。; 刘畅李绍雪高宇柴进张全陈文生; 关键词：核转录因子SP1

川西獐牙菜醇提物对大鼠胆汁酸转运蛋白Mrp4、转录因子Nrf2表达的影响被引量：9: 2015年; 目的观察川西獐牙菜醇提物对肝细胞胆汁酸转运蛋白Mrp4(multidrug resistanceassociated protein 4,Mrp4)、转录因子Nrf2的调控作用。方法将14只SD大鼠分为2组:正常对照组、川西獐牙菜醇提物组,每组7只。分别用生理盐水、川西獐牙菜醇提物处理7 d后,收集组织标本,免疫组化检测Mrp3、Mrp4在肝脏的表达变化,Western blot及RT-PCR检测胆汁酸转运蛋白Mrp3、Mrp4和转录因子Nrf2、核受体Lrh-1在蛋白及mRNA水平的变化。结果在mRNA水平,RT-q PCR结果显示川西獐牙菜醇提物组肝脏胆汁酸转运蛋白Mrp4表达较正常对照组增加2.1倍,同时,Mrp3表达增加1.7,转录因子Nrf2表达增高1.8倍,核受体Lrh-1表达增高1.4倍;在蛋白水平,Western blot结果表明川西獐牙菜醇提物组肝脏胆汁酸转运蛋白Mrp4表达较正常对照组组增加2.5倍,同时,Mrp3表达增高3.0倍,转录因子Nrf2表达增高2.3倍,核受体Lrh-1表达增高1.3倍,而免疫荧光结果则进一步证实了RT-q PCR与Western blot的结果,显示川西獐牙菜醇提物组Mrp3、Mrp4的表达较正常对照组组明显增强。结论川西獐牙菜醇提物能够刺激肝细胞表面胆汁酸转运蛋白Mrp4表达增高,这种调控作用可能与Nrf2相关。; 杜晓煌柴进封欣婵张樑君程英陈文生方勇飞; 关键词：胆汁淤积

川西獐牙菜醇提物对内毒素所致大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用被引量：11: 2014年; 目的观察川西獐牙菜醇提物对内毒素所致大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用,以及对肝细胞胆汁酸转运蛋白胆盐输出泵(bile salt export pump,BSEP)和核受体(farnesoid X-receptor,FXR)的影响。方法 20只SD雄性大鼠采用随机分为4组(每组5只):生理盐水组、川西獐牙菜醇提物组、LPS+生理盐水组、LPS+川西獐牙菜醇提物组,所有大鼠均于处理后16 h取材。统计分析各组实验大鼠肝功能指标(ALT,AST、TBIL)、胆汁流速;采用Western blot及RT-PCR观察生理盐水组、川西獐牙菜醇提物组大鼠肝组织中BSEP和FXR在转录以及蛋白水平的表达。结果 LPS+生理盐水组与生理盐水组相比肝损伤指标ALT、AST、TBIL明显升高(P<0.05),胆汁流速明显下降(P<0.05);而LPS+川西獐牙菜醇提物组与LPS+生理盐水组相比ALT、AST、TBIL明显下降(P<0.05),胆汁流速明显升高(P<0.05)。川西獐牙菜醇提物组与生理盐水组相比BSEP蛋白水平的表达明显增高(P<0.05);与BSEP调控密切相关的核受体FXR蛋白和mRNA表达变化均不明显。LPS+生理盐水组与生理盐水组相比相比BSEP蛋白水平的表达明显降低(P<0.05);而LPS+川西獐牙菜醇提物组与LPS+生理盐水组相比BSEP蛋白水平的表达明显增高(P<0.05);但各组之间BSEP mRNA变化均不明显。结论川西獐牙菜醇提物能明显减轻内毒素诱导大鼠胆汁淤积性肝损伤,这可能与上调肝细胞胆酸转运蛋白BSEP的表达有关,而且BSEP表达的上调可能是通过转录后水平调节的。; 高宇柴进李绍雪刘畅程英刘潇聪连伟陈文生; 关键词：胆汁淤积肝损伤 BSEP

阻塞性肝胆汁淤积下转录因子NR5A2和SP1、胆酸转运蛋白MRP3与肝脏损伤的相关性被引量：7: 2012年; 目的研究阻塞性胆汁淤积下肝脏中转录因子NR5A2、SP1表达是否上调,以及其表达上调与胆酸转运蛋白MRP3基因的表达是否密切相关;MRP3表达上调是否具有减轻阻塞性胆汁淤积肝脏损伤的作用。方法收集阻塞性胆汁淤积组(胆结石或肝内胆管结石引起的黄疸患者手术切除的肝脏)和正常对照组(排除肝脏疾病的活检肝组织及肝转移癌无黄疸的患者肝脏)肝脏样品各15例。采用半定量PCR和免疫荧光方法检测NR5A2、SP1基因的表达,利用独立样品t检验和线性回归分析阻塞性胆汁淤积肝组织样品中MRP3 mRNA表达上调是否与NR5A2或SP1呈正相关,以及MRP3表达上调与反映肝脏损伤的指标ALT、AST是否存在负相关性。HE染色观察胆汁淤积组肝细胞坏死程度和MRP3蛋白表达高低的关系。结果阻塞性胆汁淤积肝脏中NR5A2和SP1 mRNA表达显著上调,其中NR5A2 mRNA增高3.7倍(P<0.01),SP1 mRNA上升3.2倍(P<0.01)。免疫荧光结果表明,阻塞性胆汁淤积组NR5A2和SP1蛋白表达也显著增加,NR5A2或SP1蛋白与胆酸转运蛋白MRP3 mRNA表达呈显著正相关(分别为r2=0.47,P<0.05和r2=0.51,P<0.01);MRP3蛋白表达与肝细胞坏死程度存在密切相关,并且MRP3蛋白表达量与ALT和AST均呈显著负相关(分别为r2=0.52,P<0.01和r2=0.39,P<0.05)。结论人阻塞性胆汁淤积下NR5A2和SP1表达上调,可诱导胆酸转运蛋白MRP3的表达,而MRP3表达上调可能有减轻肝脏损伤的作用。; 何孝崇柴进何宇王槐志陈文生; 关键词：转录因子 SP1 MRP3 胆汁淤积

齐墩果酸对阻塞性胆汁淤积大鼠胆酸转运蛋白OSTα/β和BSEP的调控作用被引量：2: 2016年; 目的建立胆道结扎大鼠模型,观察胆道结扎所致肝外胆汁淤积时齐墩果酸对肝细胞表面胆酸转运蛋白OSTα/β和BSEP的调控作用。方法随机将45只SD大鼠分为9组,每组5只。假结扎组(Sham组)、胆道结扎组(BDL组)和齐墩果酸组(BDL+OA组)分别用生理盐水、齐墩果酸处理3 d、7 d、14 d后收集组织样本,提取肝脏RNA和总蛋白,分别在mRNA水平和蛋白水平检测OSTα/β和BSEP的表达变化。结果大鼠胆道结扎后,齐墩果酸干预3 d,胆酸转运蛋白OSTβ在mRNA和蛋白水平均增高,随着齐墩果酸干预时间的延长,在第7天时,胆酸转运蛋白BSEP的表达亦出现增高。第14天时,OSTα、OSTβ、BSEP表达均增高。结论齐墩果酸能够上调阻塞性胆汁淤积胆酸转运蛋白OSTα、OSTβ、BSEP的表达。; 柴进向国春封欣婵张樑君程英陈文生; 关键词：胆汁淤积齐墩果酸

川西獐牙菜单体齐墩果酸上调阻塞性胆汁淤积大鼠肝脏核受体Lrh-1和胆酸转运蛋白Mrp3的表达被引量：2: 2015年; 目的建立胆道结扎的大鼠模型,观察川西獐牙菜活性单体齐墩果酸(oleanolic acid,OA)对胆道结扎所致的肝外胆汁淤积的保护作用,及其对多药耐药相关蛋白3(multidrug resistanceassociated protein 3,Mrp3)、核受体Lrh-1的调控作用。方法采用随机数字表法将15只SD大鼠分为3组:假结扎组(Sham组)、胆道结扎组(BDL组)、齐墩果酸组(BDL+OA组),每组5只。分别用生理盐水、齐墩果酸处理7 d后,收集组织标本,HE染色检测肝脏损伤程度,Western blot及RT-PCR检测Mrp3和Lrh-1在蛋白及mRNA水平的变化。结果 HE染色结果显示BDL+OA组肝脏损伤程度较胆道结扎组明显减轻;Western blot结果表明BDL+OA组Mrp3表达较Sham组增加2.4倍,Lrh-1表达增加1.8倍;RT-PCR结果显示BDL+OA组Mrp3表达较Sham组增加3.2倍,Lrh-1表达升高2.2倍。结论川西獐牙菜单体齐墩果酸对胆道结扎所致大鼠胆汁淤积性肝损伤具有保护作用,而这种保护作用可能与Lrh-1、Mrp3有关。; 张樑君封欣婵李绍雪高宇程英陈文生柴进; 关键词：胆汁淤积齐墩果酸

Ezrin上调HepG2细胞膜转运蛋白MRP2的表达: 2015年; 目的建立Ezrin基因表达缺失的Hep G2细胞株,并研究其在胆汁淤积时对Hep G2细胞胆汁酸转运蛋白多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)的影响。方法不同位点干扰的Ezrin-shRNA质粒转染Hep G2细胞,筛选Ezrin基因表达缺失的Hep G2细胞。分别提取细胞总蛋白和膜蛋白,检测Ezrin基因表达缺失是否影响Hep G2细胞胆汁酸转运蛋白MRP2的表达。结果 RT-q PCR结果证实,Ezrin-shRNA#3质粒转染Hep G2细胞后成功抑制了Ezrin基因表达,抑制率为70%。蛋白免疫印迹表明,Ezrin基因表达缺失后,Hep G2细胞胆汁酸转运蛋白MRP2表达增高,但与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。蛋白免疫共沉淀检测生物素化MRP2膜蛋白表明,Ezrin基因表达缺失后,无论是胞浆中还是细胞膜上,MRP2膜蛋白均表达增高(P<0.05)。结论 Ezrin基因表达缺失后能够上调Hep G2细胞中MRP2膜蛋白,使其表达增高。; 柴进封欣婵张樑君程英陈兰芳胡珍陈文生; 关键词：胆汁淤积多药耐药相关蛋白2

加强临床医学研究生科研思维自我培养的思考被引量：3: 2016年; 科研思维是最基本、最重要的科研能力之一,科研思维的培养已成为研究生教学实践中的重要课题之一。本文探讨了临床医学研究生加强科研思维的自我培养,提高科研创新能力的方法。; 柴进封欣婵陈文生; 关键词：科研思维自我培养

藏茵陈上调大鼠肝细胞膜转运蛋白多耐药相关蛋白3和核受体孕烷X受体表达被引量：4: 2015年; 目的:观察藏茵陈对正常大鼠多耐药相关蛋白3(MRP3)和核受体孕烷X受体(PXR)表达的影响。方法:将10只SD大鼠随机分为藏茵陈组5只,藏茵陈100 mg·kg-1·d-1灌胃7 d;对照组5只,同体积0.9%氯化钠注射液灌胃。7 d后麻醉处死2组大鼠,取肝脏组织行HE染色检测肝脏形态变化,分别提取肝脏组织RNA、膜蛋白及核蛋白,采用实时聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹检测膜转运蛋白MRP3和核受体PXR在转录与蛋白水平的表达变化。结果:给予藏茵陈后,与0.9%氯化钠注射液比较,未影响肝脏组织的形态结构;藏茵陈可显著刺激正常大鼠肝细胞膜转运蛋白MRP3表达(P<0.01);也可明显上调核受体PXR水平增高(P<0.01)。结论:藏茵陈刺激大鼠肝细胞膜蛋白MRP3的表达上调可能与核受体PXR途径相关。; 李绍雪柴进高宇刘畅程英连伟刘潇聪陈文生; 关键词：肝疾病藏茵陈

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