上海市自然科学基金(09ZR1434800)
- 作品数：3 被引量：0H指数：0
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- 野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1真核表达载体的构建及其在小鼠足细胞中的表达
- 2012年
- 目的构建野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1(dynactin-1)真核表达载体,并观察其在小鼠足细胞中表达。方法以总RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增得到小鼠dynactin-1的全长cDNA,将该片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)-FLAG和pEGFP-N1;利用部位特异性突变插入方法构建突变型表达载体,经酶切和测序鉴定;各载体转染小鼠足细胞MPC5后,用蛋白质印迹分析法和免疫荧光显微镜法检测dynactin-1蛋白表达。结果 PCR扩增得到大小为3.8kb的小鼠dynactin-1片段,连接到载体后,酶切鉴定电泳结果分别显示pcDNA3.1(+)-FLAG(5.4kb)、pEGFP-N1(4.7kb)以及小鼠dynactin-1(3.8kb)片段,测序分析结果显示克隆的野生型和突变型小鼠dynactin-1序列与数据库序列相同;蛋白质印迹分析法检测到重组dynactin-1的蛋白条带;免疫荧光显微镜观察到dynactin-1主要表达在小鼠足细胞的细胞质。结论成功构建了野生型和突变型小鼠dynactin-1真核表达载体,并在足细胞中表达,为进一步开展细胞生物学研究奠定了实验基础。
- 王春花李林傅鹏李金花原爱红孙向华蒋晓峰余晨
- 关键词：真核表达载体足细胞
- 敲低动力蛋白激活蛋白1基因表达对足细胞分化的影响
- 2011年
- 目的:观察敲低动力蛋白激活蛋白1(dynactin1)基因表达对足细胞分化的影响。方法:用免疫荧光技术检测dynactin1在条件永生化小鼠足细胞中的表达;用RNA干扰技术抑制dynactin1的表达,用Western blot技术证实转染效率,用MTT法检测转染后细胞的生长速度,用RT-PCR技术检测转染后细胞分化标志蛋白synaptopodin的表达情况。结果:在足细胞分化过程中,细胞形态发生改变,dynactin1主要分布在核周及附近的胞浆区域;转染特异性siRNA后dynactin1蛋白表达下调,细胞生长速度明显减慢,synaptopodin mRNA表达下调,细胞分化迟滞。结论:敲低dynactin1基因表达阻滞足细胞分化。
- 李金花原爱红
- 关键词：足细胞RNA干扰分化
- 小鼠动力蛋白激活蛋白1-shRNA慢病毒载体的构建及在足细胞中的敲低效应
- 2012年
- 目的构建表达小鼠动力蛋白激活蛋白1(dynactin-1)特异性shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠足细胞dynactin-1的敲低效果。方法针对小鼠dynactin-1mRNA序列,设计合成3种shRNA,克隆到入门质粒pENTR/pTER中,再利用LR反应重组到pLenti X2Puro慢病毒目的质粒,经过酶切测序鉴定后,将慢病毒质粒和包装质粒共转染293FT细胞,包装得到病毒颗粒。各组shRNA病毒载体转染小鼠足细胞后,用嘌呤霉素抗性筛选细胞,利用蛋白质印迹法检测各组细胞中dynactin-1蛋白的表达水平。结果构建的各组shRNA入门质粒和慢病毒载体经酶切及测序鉴定正确;慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,制备病毒颗粒,转染小鼠足细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达shRNA的足细胞系;蛋白质印迹检测结果表明转染dynactin-1-shRNA组的dynactin-1蛋白表达降低。结论构建的小鼠dynactin-1-shRNA慢病毒载体能有效降低小鼠足细胞中dynactin-1蛋白表达,为进一步研究dynactin-1在足细胞中的功能奠定了基础。
- 傅鹏原理李金花王春花李林原爱红马骏
- 关键词：RNA干扰慢病毒足细胞
