转基因生物新品种培育专项(2009ZX08008-003B)
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 相关作者：张莉陆健杜立新魏彩虹吕延飞更多>>
- 相关机构：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所扬州大学德州市畜牧兽医局更多>>
- 发文基金：转基因生物新品种培育专项大连市科技计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建及在其原代成纤维细胞中的瞬时表达被引量：1
- 2012年
- Myostatin(MSTN)基因是胚胎期肌肉形成和出生后骨骼肌生长的主要调控因子之一,通过抑制肌细胞的扩增和分化而调控肌肉的生长和发育。为了进一步揭示MSTN在绵羊成纤维细胞中的生物学功能,采用RT-PCR从绵羊肌肉组织中扩增MSTN基因,将其cDNA终止密码子TGA删除,采用定向克隆技术连接到带有水母绿色荧光蛋白(AcGFP)报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建融合蛋白重组质粒,经XhoⅠ/SacⅡ双酶切、测序鉴定后,用脂质体介导质粒转染绵羊原代成纤维细胞,观测荧光表达及用RT-PCR和Western blotting方法检测基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆绵羊MSTN基因,通过PCR方法在MSTN阅读框两端引入了XhoⅠ和SacⅡ克隆位点,成功构建pAcGFP-MSTN融合蛋白真核表达载体,重组质粒转染绵羊成纤维细胞24h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增出1138bp的转录产物,并用Western blotting检测到78ku目的蛋白的表达。本试验为研究MSTN基因在成纤维细胞和脂肪分化调控中的具体机制奠定基础。
- 陆健宋正海吕延飞赵福平张莉魏彩虹范广习丁家桐李碧春杜立新
- 关键词：MYOSTATIN真核表达载体
- 山羊myostatin基因慢病毒RNA干扰载体的构建及效果验证被引量：1
- 2012年
- myostatin基因是肌肉生长和发育的关键负调控因子之一,该基因突变或失活的物种都呈现肌肉增大的双肌表型,暗示在家畜中使该基因失活可以增加其产肉量。为了进一步揭示myostatin在山羊胎儿成纤维细胞中的生物学功能以及制备可有效失活myostatin基因的工具,将筛选的myostatin基因潜在RNA干扰靶位点连接到慢病毒干扰载体的转移质粒中,构建慢病毒介导的RNA干扰载体,验证其干扰效果。结果表明,干扰序列与转移质粒连接正确,成功构建myostatin基因慢病毒干扰载体,慢病毒三质粒共转293T细胞,获得的慢病毒颗粒可高效转染山羊胎儿成纤维细胞,Real-time PCR检测发现慢病毒干扰载体Lv322有效减少山羊胎儿成纤维细胞中myostatin基因mRNA 75%的表达(P<0.01),Western blotting检测显示myostatin蛋白则有效降低了94%(P<0.01)。本试验为研究myostatin基因的功能及制备失活转基因动物提供有效工具以及理论基础。
- 陆健张世芳张小宁刘佳森李碧春赵福平张莉魏彩虹杜立新
- 关键词：MYOSTATIN基因慢病毒载体RNA干扰
- 绵羊Myostatin基因敲除载体的构建被引量：2
- 2011年
- 根据Myostatin基因突变可导致肌肉量激增而产生"双肌"表型的特点,构建绵羊Myostatin基因置换型敲除载体。利用LA-PCR技术成功地扩增得到绵羊Myostatin基因同源臂序列,其中同源长臂4.9 kb,包括全部的exon1,intron1,exon2及部分启动子和大部分intron2;同源短臂1.1 kb,包括部分exon3和3′非翻译区序列,将二者连入PloxpII正负筛选敲除骨架载体,利用骨架载体上Neo基因替代Myostatin基因的exon3,从而成功构建专门针对Myostatin第3外显子区域缺失的置换型敲除载体PloxpⅡ-OVIS-MSTN。酶切和测序鉴定证明载体构建正确,为后续获得绵羊Myostatin基因缺失型体细胞株奠定试验基础。
- 孙丹金梅杜立新魏彩虹张莉路国彬陆健吕延飞
- 关键词：绵羊MYOSTATIN基因基因敲除
