广西壮族自治区科学研究与技术开发计划(10124001A-22)
- 作品数：6 被引量：2H指数：1
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- 应用酵母双杂交系统筛选E2F1相互作用蛋白
- 2012年
- 目的:应用酵母双杂交系统从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选E2F1转录因子的相互作用蛋白。方法:以pGBKT7-E2F1为诱饵质粒筛选人正常胃黏膜细胞的cDNA文库,得到阳性克隆,反复验证,并对验证后的阳性克隆进行测序及同源性分析。结果:从人正常胃黏膜细胞的cDNA文库中筛选得到20个阳性克隆,经测序和同源性分析,筛除假阳性克隆,最终得到18个不同的候选基因序列。其中,17个为可知基因序列,它们分别是:组织蛋白酶B、SIVA1、干扰素调节因子7、鸟苷酸激酶1、ATP酶抑制因子1、核糖体蛋白SA、纤溶酶原激活物抑制剂1 mRNA结合蛋白、精氨琥珀酸合酶1、卵泡抑素类似物3、金属硫蛋白2A、内质网钙结合蛋白1、WNT1可诱导信号通路蛋白2、CDC42效应蛋白1、可溶性半乳糖凝集素结合蛋白1、中胚层发育候选2、外切酶体成分7和含EGF腓骨蛋白样胞外基质蛋白1,尚有一未知基因片段。结论:应用酵母双杂交系统成功筛选出18种E2F1相互作用蛋白,为进一步探讨E2F1影响胃癌细胞生物学行为的分子机制奠定了基础。
- 廉超王晓通谢玉波肖强
- 关键词：酵母双杂交系统胃肿癌相互作用蛋白
- E2F-1截短体的诱饵载体的构建及检测被引量：1
- 2011年
- 目的构建E2F-1截短体的诱饵载体,并进行自激活活性和诱饵蛋白毒性检测,为应用酵母双杂交系统筛选与E2F-1相互作用蛋白建立实验基础。方法设计引物,PCR扩增E2F-1截短体,引入酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ,将E2F-1截短体连接至载体pGBKT7中,将构建成功的诱饵表达载体pGBKT7-E2F-1截短体转化到酵母菌AH 109中,采用选择性培养皿和β-半乳糖苷酶分析等方法分析检测重组质粒的自激活活性和细胞毒性。结果成功扩增了E2F-1截短体,并连接至载体pGBKT7中,测序比对结果正确,成功转化到酵母菌AH 109中,经检测无自激活活性和细胞毒性。结论成功构建了E2F-1截短体的诱饵载体,经检测无自激活活性和细胞毒性,可应用于酵母双杂交系统筛选与E2F-1相互作用的蛋白。
- 孔凡彪王晓通谢玉波肖强
- 关键词：酵母双杂交自激活
- 过表达细胞周期相关转录因子1的MGC-803细胞抗原致敏树突状细胞对胃癌细胞的杀伤作用
- 2012年
- 目的观察过表达细胞周期相关转录因子1（E2F-1）的MGC-803稳定株所制成的细胞抗原所引起的树突状细胞（Dc）介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外杀伤胃癌MGC-803细胞的作用。方法用30阻g／L重组人白细胞介素4（rhlL-4）、100μg／L重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子（rhGM—CSF）、50μg／L重组人肿瘤坏死因子-γ（rhTNF—α）和100μg/L脂多糖（LPS）联合诱导健康人外周血单个核细胞成为DC，通过形态学及流式细胞仪对DC进行鉴定；实验分E2F-1组、NC组、MGC．803组和DC组，采用细胞计数试剂盒（CCK一8）法分别在DC：T为1：5、1：10、1：20、1：40时检测T淋巴细胞的增殖；采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法在T淋巴细胞：MGC一803细胞分别为10：1、20：1、50：1时检测杀伤效果；用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测培养液中的干扰素（IFN）一叮的含量变化。结果形态学和流式细胞仪检测结果显示经诱导的DC细胞成熟特征明显，过表达E2F-1组T淋巴细胞增殖能力刺激指数（SI）值（4．42±0．23）高于空载体组（2，95±0．53）和空白对照组（3．014-0．68），差异有统计学意义（P〈0．05）；过表达E2F，1抗原致敏的DC诱导的CTL对胃癌MGC-803细胞株的杀伤率[（65．00±8．24）％]高于DC—CTL组[（45．25±7．89）％]、单纯MGC-803组[（41．83±4．79）％]、空载体组[（31．16±11．96）％]和空白对照组[（33．25±8．38）％]，差异有统计学意义（P〈0．05）；过表达E2F-1抗原组T淋巴细胞分泌IFN-1的量[（571．03±5．96）ng／L]高于空载体组[（382．85±4．94）ng／L]、MGC-803组[（390．13±7．06）ng／L]和DC组[（356．03±5．36）ng／L]，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论过表达E2F-1的MGC-803抗原致敏的DC在体外可增加T淋巴细胞的增殖，加强T淋巴细胞对MGC-803细胞的杀伤力。
- 严林海王晓通肖强
- 关键词：树突状细胞转录因子免疫杀伤干扰素-Γ
- siRNA介导的E2F-1基因沉默对胃癌细胞MGC803中Rb蛋白表达水平的影响被引量：1
- 2012年
- 目的应用RNA干扰技术研究E2F-1基因沉默在人胃癌MGC803细胞中对Rb蛋白表达的影响。方法将重组质粒E2F-1-siRNA转染MGC803细胞,筛选稳定株,利用RT-PCR检测转染前后细胞E2F-1mRNA表达水平,并通过蛋白免疫印记法(Western blot)检测各组细胞E2F-1蛋白的表达水平来验证质粒转入胃癌细胞的情况。采用Western blot检测三组细胞中总Rb蛋白和磷酸化Rb蛋白的表达情况,计算出非磷酸化Rb蛋白表达情况,统计各组间的差异。结果重组质粒E2F-1-siRNA成功转入胃癌细胞中;有效抑制了E2F-1 mRNA的表达,E2F-1蛋白水平显著下降,与阴性对照组及未转染组相比分别降低了83.2%和84.6%,去磷酸化Rb蛋白分别增加了61.22%(P<0.05)和66.60%(P<0.05),差异有统计学意义。结论沉默表达E2F-1基因后,可以有效降低Rb蛋白的水平,促进其活化形式去磷酸化Rb蛋白的产生。
- 孔凡彪王晓通韦尉元罗文肖强
- 关键词：E2F-1RB蛋白去磷酸化
- 人胃癌组织定向cDNA文库的构建
- 2011年
- 目的快速构建成人胃癌组织cDNA文库。方法从人胃癌组织分离总RNA，以含有轴IB酶切位点的oligo（dT）引物合成第1链cDNA，以含蛳IA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA，双链cDNA经sGI（IA＆IB）酶切，以CHROMA SPIN＋TE-1000柱分级分离cDNA，收集符合需要的cDNA片段并纯化，随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体λ文库。结果经检测共获得2．73×10^6个重组子，重组率约为94％，插入片段大小平均为1．2kb。结论用SMART方法构建的胃癌组织cDNA文库质量较高，为以后筛选胃癌相关基因奠定了基础。
- 吴锟谢玉波王连振肖强
- 关键词：CDNA文库胃癌定向克隆
- E2F-1过表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响及其机制
- 2014年
- 目的探讨E2F-1过表达对胃癌SGC-7901细胞增殖、生长和细胞周期的影响及其分子机制。方法采用携带E2F-1基因的重组慢病毒颗粒(LV-E2F-1-GFP)感染人胃癌SGC-7901细胞(LV-E2F-1-GFP组);以对照慢病毒颗粒(LV-GFP)感染人胃癌SGC-7901细胞作为阴性对照(LV-GFP组);空白对照组常规培养胃癌SGC-7901细胞,不作任何处理。分别采用CCK-8法检测细胞的增殖活力,流式细胞仪检测各组细胞周期的分布,RT-PCR和Western blot技术检测细胞中Skp2、Bax、Bcl-2、CylinD1和Survivin基因mRNA和蛋白的表达。结果与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-E2F-1-GFP组人胃癌SGC-7901细胞增殖活力明显降低(P<0.05),G0/G1期所占比例上升(P<0.05),Skp2、Bcl-2、CylinD1和Survivin基因的mRNA和蛋白的表达降低(P<0.05),Bax基因的mRNA和蛋白的表达上调(P<0.05),而LV-GFP组和空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论慢病毒介导E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞增殖和生长,使细胞周期停滞在G0/G1期,其机制可能与E2F-1基因过表达使胃癌细胞Skp2、Survivin、Bcl-2、CylinD1基因表达下调和Bax基因表达上调有关。
- 曹稳珑韦尉元张笑石罗文严林海谢玉波肖强
- 关键词：胃癌SGC-7901细胞E2F-1过表达
