广东省自然科学基金(05200239)
- 作品数：20 被引量：41H指数：4
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- 红霉素对4-羟基壬烯醛引起的支气管上皮细胞白细胞介素-8和谷氨酰半胱氨酸合成酶变化的影响被引量：5
- 2009年
- 目的探讨红霉素对4-羟基壬烯醛（4-HNE）引起的支气管上皮细胞（16-HBE细胞）前炎因子白细胞介素-8（IL-8）和谷氨酰半胱氨酸合成酶（1-GCS）升高的影响。方法将16-HBE细胞分为4-HNE组（10μmol／L）和健康对照组，每组样本量为4个培养皿，4-HNE刺激细胞0．5,2、4、8及12h后，检测磷酸化c—Jun氨基末端激酶（JNK）、p38丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）-1及转录激活蛋白-1（AP-1）活性的变化，观察细胞外信号调节激酶活化激酶-1（MEK-1）抑制剂PD98059对4-HNE引起的AP-1结合活性的影响；观察两组IL-8、γ-GCS和IL-8 mRNA、γ-GCS mRNA表达水平的变化；观察PD98059和红霉素对4-HNE引起的IL-8、1-GCS和1-GCS mRNA表达及红霉素对4-HNE引起的AP-1结合活性的影响。结果（1）4-HNE组在0．5,2、4、8及12h各时间段ERK-1分别为110．4±1．6、106．1±2．1、104．4±3．4、96．3±9．6和86．3±2．9，对照组分别为114．6±2．4、110．2±2．0、112．8±2．4、113．1±2．0和115．4±3．8，两组比较差异有统计学意义（均P〈0．05）；4-HNE组各时间段AP-1结合活性表达分别为90．6±2．0、85．7±2．2、78．2±2．6、70．6±1．8和64．9±4．8，对照组分别为98．6±2．1、98．7±3．4、100．1±3．8、101．3±4．2和97．4±3．6，两组比较差异有统计学意义（均P〈0．05）；PD98059可降低4-HNE引起的AP-1结合活性。（2）4-HNE组IL-8水平在2、4、8及12h分别为（87±4）、（98±4）、（102±6）及（117±6）μg/L，对照组分别为（64±4）、（65±6）、（65±5）及（64±7）μg／L，两组比较差异有统计学意义（均P〈0．05）；4-HNE组γ—GCS水平在4、8及12h分别为5．43±0．23、5．41±0．27及5．54±0．53，对照组分别为4．78±0．26、4．03±0．34及3．22±0．31，两组比较差异有统计学意义（均P〈0．05）。4-HNE组比对照组IL-8 mRNA及γ-GCSmRNA表达水�
- 于亮冉丕鑫
- 关键词：白细胞介素类红霉素4-羟基壬烯醛
- 腺病毒E1A蛋白对大鼠肺泡上皮细胞谷胱甘肽活性的影响及其机制探讨被引量：1
- 2008年
- 目的研究腺病毒E1A蛋白潜伏感染对大鼠肺泡上皮细胞谷胱甘肽（GSH）活性的影响及其机制。方法构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞，观察氧化剂刺激时细胞内GSH含量变化，检测GSH合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）催化活性的变化，通过观察γ-GCS催化亚单位（GCLC）基因蛋白表达水平、mRNA表达水平和5’-上游调控序列调控的荧光素酶活性的改变，了解影响酶活性改变的机制。结果腺病毒E1A蛋白表达抑制氧化应激时GSH的合成，抑制γ-GCS催化活性和蛋白表达水平，抑制GCLC基因mRNA表达，与5’-上游调控序列报导系统获得的结果一致。结论腺病毒潜伏感染可能通过抑制GCLC基因5’-上游调控序列的促转录活性，抑制了γ-GCS的表达和催化活性，从而抑制了氧化应激时GSH的合成，削弱机体的抗氧化作用，加重氧化损伤，可能是腺病毒潜伏感染参与慢性阻塞性肺病（COPD）发病的机制之一。
- 方怡李冰陈娟刘启才冉丕鑫
- 关键词：谷胱甘肽
- 阻断MEK1上调支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达
- 2007年
- 目的探讨MEK1信号通路与支气管上皮细胞（16-HBE）谷氨酰半胱氨酸合成酶（1-GCS）表达的关系。方法应用MEK1抑制剂PD9805950μmol／L分别孵育16-HBE2、8、16及24h。用Western印迹方法和荧光定量PCR检测细胞γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达。用显色方法检测细胞内谷胱甘肽（GSH）的含量。用Western印迹方法检测细胞c-jun的水平。结果经PD98059孵育4、8、16及24h后，γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达和细胞内GSH的含量较对照组均增加。各时间段c-jun表达较各对照组减少。结论在支气管上皮细胞中MEKI抑制剂PD98059对16-HBE的γ-GCS和GSH有明显的上调作用。阻断激活蛋白-1（AP-1）途径不能减少γ-GCS和GSH的合成。
- 于亮冉丕鑫
- 关键词：Γ谷氨酰半胱氨酸合成酶谷胱甘肽信号传导激活蛋白1
- 腺病毒E1A蛋白对大鼠肺泡上皮细胞及人肺腺癌细胞凋亡的影响被引量：1
- 2010年
- 目的:探讨腺病毒E1A蛋白对大鼠肺泡上皮细胞(CCL149)及人肺腺癌细胞(A549)在致凋亡因素TNF-α诱导下细胞凋亡影响。方法:将含腺病毒E1A基因完全编码区的Pneo-E1A质粒分别转染CCL149、A549细胞,用G418筛选抗性细胞克隆,用RT-PCR、免疫组化方法对单个细胞克隆进行筛选鉴定;将经鉴定确定的稳定转染E1A基因的阳性细胞克隆、对照质粒转染细胞克隆用致凋亡因素TNF-α刺激,用Hoechest荧光染色分析及流式细胞仪结合膜联蛋白V-FITC标记法检测细胞凋亡情况。结果:稳定转染E1A基因的CCL149细胞(C-E1A+)在30μg/LTNF-α作用前、后细胞的凋亡率分别为(2.63±0.8)%和(25.38±0.9)%,明显高于对照质粒转染细胞(C-E1A-)作用前的(0.62±0.3)%和作用后的(6.08±0.2)%,两组相比差别有统计学意义(P<0.01);稳定转染E1A基因的A549细胞(A-E1A+)在30μg/LTNF-α作用前、后细胞的凋亡率分别为(5.12±0.5)%和(19.82±1.6)%,明显高于对照质粒转染细胞(A-E1A-)作用前的(2.02±0.7)%和作用后的(9.15±1.2)%,两组相比差别有统计学意义(P<0.01)。结论:E1A蛋白能够增加细胞对致凋亡因素的敏感性,上调TNF-α诱导下的细胞凋亡。
- 陈娟张锦郑西卫郭园园付欣李冰冉丕鑫
- 关键词：腺病毒凋亡
- 苯并芘对γ谷氨酰半胱氨酸合成酶调控作用的初步研究被引量：1
- 2006年
- 目的分析苯并芘(B(a)P)对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因的调控作用。方法用超级凝胶滞留实验(Supershift)确认苯并芘(B(a)P)刺激能诱导芳香烃受体核转位因子(ARNT)或其复合物与大鼠GCLC上游调控序列中的E-box元件结合。在不同浓度苯并芘刺激下,在体外通过萤火虫荧光素酶报道系统比较大鼠GCLC5′端全长调控序列及缺失E-box位点的5′端全长调控序列的功能变化,初步确定苯并芘的调控作用。结果B(a)P刺激能够使ARNT或复合物结合E-box元件。用不同浓度的B(a)P于不同的时间点检测,CCL-149细胞荧光素酶活性改变不大(P>0·05)。结论B(a)P刺激能使ARNT与γ-GCS基因上的E-box结合,但这种结合似乎对γ-GCS基因上游调控序列基因的功能影响不大。
- 熊丽红李冰冉丕鑫
- 红霉素对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的影响被引量：3
- 2009年
- 目的:探讨红霉素对支气管上皮细胞16-HBE谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽(GSH)的影响。方法:应用红霉素5μg/ml分别孵育细胞16-HBE细胞2 h,8 h,16 h,24 h。分别应用显色法,Western blot和荧光定量PCR方法检测细胞内GSH,γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达。结果:经红霉素孵育后,16、24 h后,细胞内GSH、γ-GCS重链蛋白和mRNA的表达较对照组增加。结论:红霉素对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和GSH的合成有上调作用。
- 于亮李冰冉丕鑫
- 关键词：谷胱甘肽红霉素
- 腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位表达的机制研究被引量：1
- 2008年
- 目的:研究腺病毒E1A蛋白抑制大鼠肺泡上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)表达的机制。方法:构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞,将GCLC基因5’-上游调控序列不同长度的缺失体-萤火虫荧光素酶报道系统转染后分析转录活性的变化;检测AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因调控序列的结合活性。结果:GCLC基因5’-上游调控序列报道系统检测结果显示大部分(9/11)缺失体的转录活性抑制,AP-1、NF-κB、USF与GCLC基因的结合活性增强,而对应的功能元件的转录活性降低。结论:腺病毒E1A蛋白通过抑制GCLC基因5’-上游调控序列的转录活性,扩大大鼠肺泡上皮细胞氧化应激时的氧化/抗氧化失衡,其机制可能涉及E1A对辅助转录因子的抑制。
- 方怡李冰陈娟刘启才冉丕鑫
- 关键词：Γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶慢性阻塞性
- 香烟对气道上皮细胞表达4-羟基壬烯醛的影响以及银杏内酯B的干预作用被引量：7
- 2006年
- 目的探讨香烟烟雾浓缩物(CSC)对人类支气管上皮细胞系(16-HBE)表达4-羟基壬烯醛(4-HNE)的影响以及银杏内酯 B 的干预作用;并观察4-HNE 对中性粒细胞的趋化作用。方法采用免疫细胞化学和 Western blot 方法。(1)不同浓度(1、10μg/ml CSC)CSC 刺激16-HBE 细胞4h后4-HNE 加成蛋白的表达水平,设正常对照组(无血清培养基代替 CSC);(2)10μg/ml CSC 刺激不同时间(1、4、8、12、24、30h)后,16-HBE 中4-HNE 加成蛋白的水平,设正常对照组(无血清培养基代替 CSC);(3)用100μmol/L 银杏内酯 B 孵育16-HBE 后,CSC 刺激1、4、8、12h,检测4-HNE 加成蛋白表达的变化,设正常对照组(无银杏内酯 B 孵育);(4)以趋化实验检测0.1、1、10μmol/L 4-HNE 对兔中性粒细胞的趋化作用。结果(1)1、10μg/ml CSC 刺激4h 后,16-HBE 细胞表达4-HNE 加成蛋白水平(免疫化学为2.12±0.38、2.69±0.42,Western blot 为100.2±6.3、72.3±6.1)均较正常对照组显著增加(免疫化学为1.25±0.37,Western blot 为122.4±4.2,P 均<0.01)。(2)10μg/ml CSC 刺激1、4、8、12、24、30h后,16-HBE 细胞表达4-HNE 加成蛋白(免疫化学为2.67±0.46、2.69±0.42、2.71±0.48、2.72±0.56、2.93±0.11、2.92±0.20,Western blot 为73.2±8.3,72.3±6.4,72.6±9.2,71.5±8.1,54.4±3.6,56.7±4.4)较正常对照组(免疫化学为1.25±0.35,Western blot 为122.4±4.1)显著增加(P 均<0.01),刺激24h 和30h,细胞内4-HNE 加成蛋白较其他时间点增加。(3)50、100μmol/L 银杏内酯 B 孵育后再以 CSC 刺激时,16-HBE 细胞内4-HNE 加成蛋白表达水平(Westernblot 为84.6±4.4、101.2±4.4)明显低于未以内酯 B 孵育组,但高于正常对照组(Western blot 为72.5±6.4,P 均<0.01)。(4)0.1、1、10μmol/L 4-HNE 对兔中性粒细胞趋化数目(92±12、104±16、131±12)较正常对照组(72±12)均显著增加,10 μmol/L 4-HNE 趋化数目显著高于0.1和1μmol/L4-HNE,差异均有统计学意义(P 均<0.01)。结论香烟所引起肺中性粒细胞趋化的结果可能与其促
- 于亮冉丕鑫
- 关键词：4-羟基壬烯醛银杏内酯B中性粒细胞
- 腺病毒早表达蛋白1A对大鼠细胞间黏附分子1的影响被引量：7
- 2007年
- 目的探讨腺病毒早表达蛋白1A(E1A)对脂多糖、肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的大鼠肺泡上皮细胞炎症介质细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响及其机制。方法致炎因素脂多糖和 TNF-α作用于稳定表达 E1A 的大鼠肺泡卜皮细胞、对照质粒转染细胞和正常大鼠肺泡上皮细胞,采用流式单抗和 RT-PCR 法分析 ICAM-1蛋白水平和 mRNA 水平的表达情况;转录因子报告系统和凝胶电泳迁移变动分析(EMSA)研究核因子(NF-κB)、活化蛋白1与 ICAM-1基因上游调控元件结合的情况。结果 (1)与对照质粒组和正常细胞组相比,E1A 阳性组细胞经10 mg/L 脂多糖和10 pg/L TNF-α刺激后,ICAM-1蛋白表达(任意荧光强度)为109±15和185±20,比对照质粒转染组细胞(60±13,86±22)和正常 CCL149细胞(61±20,89±12)明显升高(F 值分别为14.46、73.64,P 均<0.01);(2)RT-PCR 显示 E1A 阳性组细胞 ICAM-1 mRNA 的表达在脂多糖、TNF-α刺激后3h和6h 均比对照质粒转染组细胞明显增高;(3)转录因子荧光素酶报道系统及 EMSA 结果显示,E1A组在脂多糖、TNF-α作用前后,细胞核内 NF-κB与 ICAM-1基因上游调控序列结合形成的阻滞条带强度均明显高于埘照组;而活化蛋白1与 ICAM-1基因上游调控序列特异性结合形成的阻滞条带在E1A 阳性组和对照组在刺激因素作用前后比较无明显差异;(4)在脂多糖作用后,NF-κB抑制剂 N-甲苯磺基-L-苯乙胺酰氯甲基酮(TPCK)可使 E1A 组 ICAM-1蛋白表达强度下降(109±15,50±10);TNF-α作用后 E1A 组 ICAM-1蛋白表达强度也明显下降(185±20,55±13),TPCK 处理前后比较,差异有统计学意义(t 值分别为8.4、12.2,P 值分别为0.01和0.00)。结论 E1A 可明显上调炎症介质ICAM-1的表达,上调转录因子 NF-κB、活化蛋白1的活性;E1A 上调 ICAM-1的表达主要通过 NF-κB实现。
- 陈娟李冰罗健东张丹丹冉丕鑫
- 关键词：腺病毒科病毒潜伏期即早蛋白质类
- 人支气管上皮细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶催化亚单位基因转录的调控被引量：1
- 2008年
- 目的:研究人支气管上皮细胞谷胱甘肽(GSH)合成的限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因转录调控。方法:通过PCR的方法克隆GCLC基因的部分转录调控区基因,构建表达虫荧光素酶报告基因的质粒;采用外切核酸酶Ⅲ结合S1核酸酶的方法构建了GCLC基因部分转录调控区基因的嵌套缺失体;基因转染上述质粒,通过虫荧光素酶报告基因的表达分析揭示嵌套缺失体突变基因的转录调控功能。结果:人GCLC基因转录起始位点上游-2515～-2236bp、-864～-838bp、-769～-538bp、-421～-341bp区间的转录调控区为正性转录调控区,为新发现的转录调控区域;而-810～-769bp区间特别是-782～-769bp区间为负性转录调控区,它的定位范围较原来更精确。结论:本研究有助于进一步深入探讨人支气管上皮细胞GCLC基因的转录调控,为γ-GCS及GSH的合成调控研究提供了良好的前期实验基础。
- 邹国明李冰冉丕鑫
- 关键词：基因转录调控谷胱甘肽
