转基因生物新品种培育专项(2009ZX08008-009B)
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
- 相关作者：曹少先孟春花丰秀静王慧利王锋更多>>
- 相关机构：江苏省农业科学院南京农业大学扬州大学更多>>
- 发文基金：转基因生物新品种培育专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 通用型动物转基因载体的构建及验证被引量：2
- 2012年
- 为了构建通用型动物转基因载体,以pBluescriptⅡKS+为基础,根据标记基因所含酶切位点,设计改造多克隆位点,插入从pTARGET载体中扩增的SV40启动子及新霉素磷酸转移酶基因(Neo),其下游插入共表达序列、增强型绿色荧光蛋白质基因(EGFP)及SV40 poly A,并在SV40启动子上游和SV40 poly A下游各添加一个同向的LoxP位点,构建成通用载体pNIGFP,标记基因上游拥有Xho I、Sal I、SacⅡ多克隆位点,下游拥有Nhe I、Cla I、Sac I位点。酶切鉴定和测序表明pNIGFP构建正确。pNIGFP脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,荧光显微镜下观察到EGFP高表达。遗传霉素(G418)筛选表明,Neo基因表达正常,山羊胎儿成纤维细胞的最适筛选浓度为600"g/ml。pNIGFP可利用G418进行抗性筛选,还可通过EGFP表达对外源基因的整合进行实时跟踪,另外,该载体具有LoxP位点,外源基因整合后可用Cre重组酶去除标记基因,具有高效、方便、安全的特点。
- 丰秀静田石蒋进孟春花茆达干曹少先
- 关键词：LOXP
- 脂质体LTX介导高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)条件的优化被引量：3
- 2011年
- 探讨获得外源基因高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)的方法,为筛选出体细胞核移植的供核细胞,制备转基因山羊提供技术基础。该研究以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对细胞接种量、质粒DNA用量、脂质体与质粒DNA比例、脂质体-DNA复合物与细胞作用时间进行优化,荧光显微镜下统计转染后24 h的转染效率。结果显示:在24孔培养板中,每孔接种细胞6×104个,24 h后进行转染,质粒DNA每孔0.6μg,脂质体与质粒DNA比例为4.5∶1.0,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6 h时,转染效率最高,达到81.2%。
- 丰秀静曹少先孟春花王慧利钱勇王锋成勇
- 关键词：转染效率脂质体绿色荧光蛋白
- 人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达
- 2012年
- 采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。
- 苏磊曹少先丰秀静田石孟春花王慧利张庆晓王锋
- 关键词：基因克隆
- 人α-乳白蛋白转基因载体的构建及其奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立
- α-乳白蛋白（alpha lactalbumin,α-LA）是乳清蛋白中结合钙离子的主要蛋白,能提高免疫力,具有抗癌、抗微生物的功效。其所含丰富的必需氨基酸和支链氨基酸有助于促进婴儿的神经发育,已在婴儿配方食品中得到广泛...
- 丰秀静
- 关键词：转染转基因载体
- 基于GFP的锌指核酸酶真核细胞筛选体系的构建与验证
- 2014年
- 旨在构建基于GFP报告基因的ZFN真核细胞筛选体系,为ZFN的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法。以pEGFP-N1为基础,去除EGFP基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入ATG,构建筛选体系的通用载体pEGFP-ATG。将ZFN的靶序列插入到通用载体EGFP基因上游,且使起始密码子和EGFP基因处于不同ORF中,构建筛选载体pEGFP-728。将pEGFP-728转入Hela细胞中,G418筛选Hela-728细胞系,转染ZFN到Hela-728,48h内通过观察荧光判断ZFN是否有效,挑取荧光细胞进行PCR、测序验证靶序列的敲除。测序分析表明,通用载体pEGFP-ATG和含靶序列的筛选载体pEGFP-728序列完全正确;pEGFP-728转入Hela细胞中观察不到绿色荧光,说明靶序列插入后使EGFP发生移框;转染靶序列对应的ZFN到Hela-728中,48h观察到荧光的表达,说明ZFN有效;挑取6个荧光细胞单克隆,PCR、测序表明4个克隆靶序列发生缺失突变。锌指核酸酶真核细胞筛选体系构建成功。相对于其他方法本筛选体系更加准确、直观、灵敏,更适用于动植物等真核细胞的ZFN筛选,同时还可应用于TALEN和CAS9的筛选。
- 李静心王慧利孟春花张庆晓蒋进蒋进王婧
- 关键词：锌指核酸酶绿色荧光蛋白真核细胞
