高等学校科技创新工程重大项目(207150)
- 作品数：8 被引量：9H指数：2
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- CEA特异性RNAi增强基因工程腺病毒H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤被引量：1
- 2009年
- 目的研究癌胚抗原(CEA)特异性基因沉默对基因工程腺病毒H101杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响,以探讨影响H101敏感性的内在因素。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对人食管癌EC9706细胞的CEAsiRNA载体,通过基因转染,在EC9706细胞中建立稳定的CEA基因沉默体系,并以空载体转染和未进行转染的EC9706细胞作对照,建立人食管癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,H101瘤内注射。用RealTimePCR和免疫组化法检测CEA在移植瘤中的表达,测量肿瘤体积。结果降低CEA在mRNA和蛋白质水平的表达,对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤时间和大小无明显影响,H101瘤内注射后,干扰组肿瘤体积显著小于空载体组和对照组(P<0·05)。结论抑制食管癌EC9706细胞中CEA的表达,能增强H101的敏感性。
- 郑红赵国强杨洪艳赵继敏王尧河董子明
- 关键词：EC9706裸鼠
- 人舌癌Tca8113核外体对树突状细胞诱导CTL杀伤活性的影响
- 2008年
- 目的:探讨人舌癌Tca8113细胞核外体(exosomes)体外诱导外周血来源的树突状细胞(dendritic cell,DC)对CTL杀伤活性的影响。方法:抽取健康成人外周血,分离单核细胞,经贴壁获得树突状细胞前体细胞,在体外先后加入GM-CSF、rhIL-4、LPS和/或exosomes诱导培养9d,获得成熟DC;而未贴壁细胞经rhlL-2诱导培养,获得T淋巴细胞。设置舌癌Tca8113组和对照EC9706组,每组再根据效应细胞不同分为A组:Tca8113细胞核外体致敏的DC与T淋巴细胞共培养组;B组:未经致敏DC与T细胞共培养组;C组:单纯T细胞组。结果:A、B、C组效应细胞对Tca8113细胞株的杀伤活性分别为(78.56±2.26)%、(50.34±6.21)%、(26.47±3.52)%。A与B组、A与C组比较差异有统计学意义(P<0.05),A组效应细胞对EC9706杀伤活性为(51.18±5.31)%,与对Tca8113的杀伤活性相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:人舌癌Tca8113核外体能增强DC-CTL效应细胞对舌鳞癌Tca8113细胞株特异性的杀伤活性。
- 郑红卫艳萍赵国强董子明
- 关键词：树突状细胞CTL
- CEA慢病毒载体的制备及其在树突状细胞中的表达鉴定
- 2009年
- 目的构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定表达CEA的树突状细胞(DC)。方法以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致。将pLentiGFP-CEA、包装质粒p△8.2和pVSV-G用LipofectamineTM2000共同转染293T细胞,包装成感染性病毒颗粒,感染树突状细胞,并进行RT-PCR和Westernblot检验CEA在细胞中的表达。结果DC细胞病毒感染48h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达,PCR扩增可得到人CEA的2009bp基因片段,与预期大小一致,Westernblot显示CEA在感染DC中表达。结论成功构建了CEA慢病毒表达载体,重组慢病毒感染DC细胞后表达出有活性的CEA蛋白,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础。
- 郑红张文玲赵国强董子明
- 关键词：癌胚抗原慢病毒载体树突状细胞
- 调控食管癌癌胚抗原基因表达对溶瘤腺病毒H101抗癌作用的影响
- 2011年
- 目的研究调控食管癌癌胚抗原（CEA）基因表达对溶瘤腺病毒H101抗癌作用的影响，探讨影响H101敏感性的内在因素。方法选择CEA低表达的EC9706细胞株（EC9706．SCEA）和CEA过表达的EC9706细胞株（EC9-06-CEA）复苏培养，细胞生长实验检测调控EC9706细胞CEA基因表达对细胞生长的影响，通过细胞毒性实验和裸鼠体内实验检测H101对不同CEA表达水平EC9706细胞的杀伤效果。结果细胞生长实验表明，EC9706-SCEA、EC9706-CEA和EC9706细胞群体倍增时间分别为（30．9±2．0）h、（31．1±2．5）h和（29．1±2．6）h，差异无统计学意义（P〉0．05）。细胞毒性实验显示，当感染复数（MOI）〉10．01PFU时，H101对EC9706-SCEA细胞的抑制率明显高于EC9706、EC9706-CEA、EC9706-siCon和EC9706-Con细胞（P〈0．05）。不同时间各组裸鼠移植瘤体积测定显示，H101对治疗组裸鼠皮下移植瘤的生长均有抑制作用，但其对EC9706-SCEA治疗组移植瘤生长的抑制作用（抑瘤率为61．5％～74．5％）显著强于EC9706治疗组（抑瘤率为35．5％～44．8％）和EC9706-CEA治疗组（抑瘤率为32．3％～38．5％），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论溶瘤病毒H101对EC9706-SCEA细胞的杀伤力明显增强。沉默CEA基因的表达，有望成为提高溶瘤病毒H101抗癌效果的新途径。
- 郑红李明善赵国强董子明
- 关键词：食管肿瘤癌胚抗原溶瘤腺病毒裸鼠
- 慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立被引量：3
- 2010年
- 目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒si RNA和表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞。方法:构建CEAsi RNA载体:依据si RNA靶序列设计原则,针对人CEA的cDNA序列,设计并合成编码si RNA的3对寡核苷酸序列,克隆入si RNA载体(pRNAT-U6.2/Lenti)中构建3个重组体pRNAT-U6.2-SCEA。构建CEA表达载体:以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLenti GFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致。然后进行重组慢病毒分别感染EC9706细胞,G418筛选得到稳定感染细胞株。分别用荧光定量Real-ti me RT-PCR和Western blot检测EC9706细胞中CEA基因表达抑制或增强的效果。结果:EC9706病毒感染48 h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达,经过RT-PCR和Western-blot验证:得到3株稳定CEA低表达的EC9706细胞株,其中一个CEA的表达几乎得到完全抑制,1株稳定CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA)。结论:建立了稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞株,成功调控食管癌EC9706细胞中CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础。
- 郑红林波赵国强董子明
- 关键词：EC9706慢病毒载体
- 癌胚抗原慢病毒表达载体的制备及鉴定
- 2009年
- 目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达。方法:提取CEA阳性的人结肠癌组织总RNA,逆转录获得cDNA序列,CEA全基因引物进行PCR扩增,对所扩增出的大小约2100bp的基因片段胶回收纯化,与pGEM-T Easy载体连接得到重组质粒pGEM-T-CEA。分别用XhoL和HindⅢ双酶切重组质粒pGEM-T-CEA和慢病毒载体pLentiGFP,将双粘CEA片段与羟化后的双粘线形载体pLentiGFP连接得重组载体pLentiGFP-CEA。pLentiGFP-CEA与慢病毒辅助包装载体pΔ8.2和pVSVG共转染293FT细胞,Western Blot验证CEA在转染293FT细胞中表达,72h后收集病毒上清。结果:通过PCR扩增获得了CEA基因,将CEA正向克隆到慢病毒转移质粒pLentiGFP中,并在293FT细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论:成功构建了CEA慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨CEA功能奠定了基础。
- 郑红张文玲赵国强董子明
- 关键词：CEA慢病毒载体
- CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用被引量：7
- 2007年
- 目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.
- 郑红赵国强杨洪艳刘康栋冯龙董子明
- 关键词：小干扰RNA癌胚抗原
- 癌胚抗原表达对E1B缺失型腺病毒H101抗癌作用的影响
- 2011年
- 目的:研究调控食管癌CEA基因表达对E1B缺失型腺病毒H101抗癌作用的影响,探讨影响H101敏感性的内在因素。方法:选择CEA低表达的EC9706细胞株(EC9706-SCEA)和CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA)复苏培养,细胞生长实验检测调控食管癌EC9706 CEA基因表达对细胞生长的影响,然后通过细胞病变效应(CPE)试验和细胞毒性实验(WST-8检测法)检测H101对表达不同CEA水平EC9706细胞的杀伤效果。结果:细胞生长实验表明,EC9706-SCEA和EC9706-CEA、EC9706细胞生长曲线形态相似,细胞群体倍增时间分别为(30.9±2.0)h(、31.1±2.5)h、(29.1±2.6)h,统计分析无明显差异(P>0.05)。CPE试验和细胞毒性实验表明,H101对EC9706-SCEA杀伤抑制作用明显强于对EC9706-CEA、EC9706的作用(P<0.05)。结论:体外细胞实验证实,H101对CEA低表达EC9706细胞的杀伤力明显增强。沉默CEA基因的表达,有望成为提高溶瘤病毒H101抗癌效果的新途径。
- 郑红梁红霞赵国强董子明
- 关键词：癌胚抗原EC9706
