国家杰出青年科学基金(39525021)
- 作品数：11 被引量：57H指数：5
- 相关作者：董志伟寿成超吴健杨峻山安平更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院北京肿瘤医院北京医科大学临床肿瘤学院更多>>
- 发文基金：国家杰出青年科学基金北京市科委基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 血管内皮生长因子受体Flt-1结合小肽抑制肿瘤生长的实验研究被引量：5
- 2002年
- 目的 检测从十二肽库中筛选获得的能与血管内皮细胞生长因子 (VEGF)受体Flt 1结合的小肽的生物学活性。方法 免疫细胞化学方法检测小肽融合蛋白DHFR F5 6 /F90与人脐静脉内皮细胞的结合活性 ;鸡胚尿囊膜血管增生抑制实验检测DHFR F5 6 /F90能否抑制鸡胚新生血管形成 ;裸鼠成瘤实验检测DHFR F5 6 /F90对荷瘤裸鼠中肿瘤的生长抑制 ;免疫组织化学方法检测DHFR F5 6 /F90能否定位于肿瘤组织。结果 小肽融合蛋白DHFR F5 6 /F90能与人脐静脉内皮细胞结合 ,DHFR F5 6能抑制鸡胚尿囊膜新生血管的形成 ,且DHFR F5 6能与肿瘤细胞结合 ,促进肿瘤组织坏死及显著抑制肿瘤生长。结论 十二肽F5 6是VEGF结合Flt 1的有效拮抗剂 ,具有抑制VEGF诱导的新生血管形成而抗肿瘤生长和转移的潜在应用前景。
- 雷和田寿成超吴健刘晓颖何洛文刘美生郭琦姜北海
- 关键词：血管内皮生长因子受体血管内皮肽库肿瘤血管生成FLT-1抑瘤作用
- 人源噬菌体抗体库中血管内皮细胞生长因子抗体的筛选及活性鉴定被引量：1
- 2000年
- 目的 从人噬菌体Fab抗体库中筛选抗人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)抗体克隆 ,并对其特异性及活性进行分析 ,为后续工作奠定基础。方法 从不同人群外周血淋巴细胞提取总RNA ,经逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)分别扩增轻、重链抗体Fab段 ,用噬菌体表面呈递技术构建抗体库 ,经过 4轮固相筛选及单克隆差异筛选 ,获得能结合VEGF的抗体克隆。在此基础上通过ELISA、Westernblot和3 H TdR参入分别对所获抗体克隆的特异性及中和活性进行分析 ,并对阳性克隆DNA进行测序分析。结果 构建了 1.5× 10 8人组合噬菌体抗体库 ,并筛选获得了结合VEGF的人噬菌体抗体Fab段。Westernblot表明所获抗体能较好结合VEGF ,3 H TdR参入实验显示其中一株抗体可中和VEGF引起的内皮细胞增殖作用。DNA序列分析表明所获抗体片段为人源VH6亚群抗体重链基因和VJC重排后的VL4亚群抗体轻链基因。结论 利用噬菌体抗体库技术可直接获得特异人源VEGF抗体 ,为进一步通过基因工程改造 ,获得有临床应用价值的VEGF抗体提供了新的可能性。
- 田学军寿成超董志伟
- 关键词：内皮生长因子VEGF抗体
- VEGF及其受体在人胃癌细胞MGC803的共表达及VEGF对MGC803细胞的促增殖效应被引量：3
- 1999年
- 血管内皮细胞生长因子 (VEGF)在许多肿瘤细胞有异常高表达 .应用RT PCR从人胃癌细胞MGC80 3中扩增获得了VEGF及其受体KDR的特异片段 ;细胞免疫化学结果显示在MGC80 3细胞上有KDR的强阳性着染 ,说明在胃癌细胞MGC80 3中存在VEGF及其受体KDR的共表达 .3H TdR掺入实验表明 :外源性VEGF16 5对胃癌细胞MGC80 3有明显的促增殖作用 ,抗VEGF16 5单抗及抗KDR单抗均可阻断VEGF的这种刺激作用 .从而提示VEGF可能作为肿瘤细胞的自分泌促生长因子发挥作用 ,为进一步认识VEGF在肿瘤发生中的作用提供了新的依据 .
- 田学军孟麟寿成超董志伟
- 关键词：肿瘤细胞VEGF胃癌细胞增殖共表达
- 短肽库中血管内皮细胞生长因子受体Flt-1拮抗剂筛选条件的改进被引量：2
- 2001年
- 目的 :改进噬菌体肽库的筛选条件 ,提高筛选阳性率及阳性克隆重复性。使血管内皮细胞生长因子受体Flt 1拮抗剂的筛选更为有效。方法 :通过对血管内皮细胞生长因子受体Flt 1的原核表达产物的变性复性处理 ,获得相对纯化的可溶性Flt 1受体。将该可溶性受体固相化 ,对噬菌体表达 12肽库进行 4～ 5轮Bio panning后 ,挑取单个噬菌斑制备高滴度噬菌体上清。用ELISA法初步鉴定各噬菌体克隆与sFlt 1的特异性结合并测定阳性克隆的DNA顺序。在Bio panning过程中增加非特异性蛋白的预吸附 ,并减少输入噬菌体数量 ,再次筛选短肽库。结果 :经过第一次筛选 ,获得了一系列具有一定重复性与同源性的噬菌体克隆。改进筛选条件后 ,筛选阳性率由2 %提高到 8.3% ,阳性克隆的重复性也得到显著提高。该高重复阳性克隆的氨基酸顺序与前一次筛选获得的阳性克隆有较高同源性。结论 :Bio panning条件的改进提高了筛选效率 ,为不纯蛋白筛选短肽库积累了经验 ,并为血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂的研制奠定了基础。
- 安平寿成超孟麟董志伟
- 关键词：血管内皮细胞生长因子受体拮抗剂噬菌体VEGF受体
- 人源分泌型血管内皮细胞生长因子受体flt-1(Ⅰ～Ⅳ/区)的基因克隆及其腺病毒载体的构建和表达被引量：7
- 2002年
- 肿瘤的生长、转移与血管形成密切相关 ,利用基因治疗的方法将抗血管形成的因子导入体内是目前肿瘤生物治疗研究的重要策略 .血管内皮细胞生长因子 (VEGF)在血管生成中起重要作用 ,因此阻断VEGF与相应受体的结合成为抗血管形成的重要靶点 .通过RT PCR从人脐静脉内皮细胞克隆了VEGF受体Flt 1的信号肽及胞外Ⅰ～Ⅳ区cDNA ,即可溶性sFlt 1的cDNA片段 .利用Ad Easy体系 ,在细菌BJ5 183中同源重组后 ,转染包装细胞 2 93,成功包装出重组flt 1腺病毒 ,利用它可有效地感染低分化胃黏液腺癌细胞株MGC80 3.经RT PCR ,免疫沉淀及免疫印迹等不同方法检测表明 ,被感染细胞能表达并分泌Flt 1的胞外区蛋白 ,为后续进行抗肿瘤血管形成的基因治疗研究奠定了基础 .
- 张华寿成超
- 关键词：FLT-1基因克隆腺病毒载体肿瘤
- 小肽融合蛋白通过阻断VEGF与KDR结合抑制血管生成与肿瘤生长被引量：10
- 2002年
- 血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）结合酪氨酸激酶受体ＫＤＲ／ＦＬＫ１能促进血管形成．筛选能封闭ＶＥＧＦ与ＫＤＲ相互作用的小肽可以通过阻断血管形成而抑制实体瘤生长．将从噬菌体１２肽库中筛选而获得的能与ＫＤＲ结合的１２肽Ｋ２３７ ＤＮＡ克隆到表达载体ｐＱＥ４２中，在大肠杆菌Ｍ１５中稳定表达二氢叶酸还原酶融合蛋白ＤＨＦＲ－Ｋ２３７，经变性、复性后得到纯度达９０％的可溶性蛋白．体外实验显示，ＤＨＦＲ－ Ｋ２３７能竞争抑制ＶＥＧＦ结合ＫＤＲ，显著抑制由ＶＥＧＦ刺激而引起的人脐静脉内皮细胞增殖；体内实验表明，ＤＨＦＲ－Ｋ２３７能显著抑制鸡胚尿囊膜血管形成和荷瘤裸鼠中肿瘤的生长．结果表明，１２肽Ｋ２３７是ＶＥＧＦ结合ＫＤＲ的有效拮抗剂，具有抗肿瘤生长和转移的潜在应用前景．
- 雷和田寿成超刘晓颖何洛文吴健姜北海刘美生杨峻山
- 关键词：血管内皮细胞生长因子VEGF受体小肽抗血管形成KDR
- 血管内皮细胞生长因子受体KDR胞外配基结合区单抗对内皮细胞增殖及血管形成的抑制被引量：13
- 2000年
- 目的 研制能封闭血管内皮生长因子 (VEGF)受体KDR的单克隆抗体 (McAb) ,探讨其抑制VEGF诱导的体内外活性。方法 以原核表达的KDRⅠ～Ⅳ区融合蛋白免疫BALB/c小鼠 ,用杂交瘤技术制备抗KDRⅠ～Ⅳ的McAb ,并用免疫双扩、ELISA和Western免疫印迹鉴定其亚类和抗原结合特异性 ,用VEGF刺激内皮细胞增殖及鸡胚血管形成实验检测该抗体的中和活性。结果 通过筛选和鉴定获得了 2株KDRⅠ～Ⅳ区McAbs(3G9、1E4) ,其分泌抗体亚类分别为IgG1和IgM。 2株McAb均能明显抑制VEGF诱导的内皮细胞 (EC)增殖 ,经纯化的McAb 3G9能明显抑制经VEGF刺激的鸡胚血管形成。结论 KDRⅠ～Ⅳ区McAb可能通过封闭内源性KDR而抑制VEGF活性 ,McAb 3G9具有潜在治疗肿瘤的应用前景。
- 宋述梅吴健寿成超
- 关键词：VEGFR内皮细胞增殖
- 血管内皮细胞生长因子受体Flt-1结合小肽的融合表达及活性鉴定被引量：3
- 2002年
- 血管内皮细胞生长因子 (VEGF)通过结合其酪氨酸激酶受体KDR、fms样酪氨酸激酶 1(Flt 1)调节新生血管形成 ;筛选能封闭VEGF结合Flt 1的小肽 ,可以通过阻断肿瘤血管形成 ,抑制实体瘤生长 .将从噬菌体 12肽库中筛选获得的 2个能与Flt 1结合的阳性噬菌体克隆 (F5 6和F90 )十二肽DNA(36bp)克隆到表达载体pQE4 2中 ,在大肠杆菌M15中稳定表达二氢叶酸还原酶融合蛋白(DHFR F5 6 F90 ) ,经变性、复性后得到纯度达 90 %的可溶性蛋白 .ELISA检测表明 ,DHFR F5 6 F90能结合可溶性受体sFlt 1和血管内皮细胞 ;12 5I VEGF竞争抑制实验显示 ,DHFR F5 6能竞争抑制VEGF同可溶性受体sFlt 1结合 .结果提示 ,F5 6可能是VEGF受体Flt 1的有效拮抗剂 。
- 雷和田吴健杨峻山寿成超
- 关键词：血管内皮细胞生长因子受体VEGFR小肽VEGFR-1活性鉴定
- 原核表达的可溶性血管内皮生长因子受体对血管内皮生长因子活性的抑制被引量：5
- 2000年
- 宋述梅寿成超
- 关键词：血管内皮VEGF受体原核表达
- 可溶性VEGF受体Flt-1的基因克隆及其活性产物在原核中的表达被引量：6
- 2000年
- 可溶性血管内皮细胞生长因子受体 ( Flt- 1 )具有受体拮抗剂作用 ,可竞争结合血管内皮细胞生长因子 ,( VEGF)并与其膜表面受体 Flt- 1及 KDR形成异源二聚体 ,最终阻断 VEGF的生物学活性 .利用 RT- PCR技术从人脐静脉内皮细胞扩增出 Flt- 1胞外 ～ 区 c DNA片段 ,通过基因重组将该片段克隆于谷胱甘肽转移酶 ( GST)融合蛋白表达载体 PGEX2 -T中 ,连接产物转化大肠杆菌XL1 - blue,经 IPTG诱导可获大量稳定表达的 Flt- 1 - GST融合蛋白 .该表达产物经变性复性处理后 ,可特异性结合 12 5 - VEGF.大量具有活性的可溶性 Flt- 1的获得有助于新的抗肿瘤血管形成方法的探索 .
- 安平董志伟寿成超
- 关键词：FLT-1原核表达结合活性
