教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-05-0574)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
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- 乙型肝炎病毒对HepG2细胞影响的蛋白质组学分析被引量：1
- 2007年
- HBV可引起急慢性肝炎、肝硬化，并与原发性肝细胞癌发生、发展关系密切。近年来，尽管HBV编码蛋白，如S蛋白、表面抗原大蛋白等，致肝细胞病变作用得到广泛重视，但HBV对宿主细胞的整体影响尚鲜见报道。本研究采用蛋白质组学相关技术，即差异凝胶电泳（differentialin—gel electrophoresis）和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI—TOF-TOFMS）技术，整体研究HBV对HepG2细胞蛋白表达的影响，鉴定其中的差异蛋白质，为更合理地探讨HBV对细胞功能的影响提供理论依据。
- 黄清玲柏世玉林建银林旭
- 关键词：HEPG2细胞乙型肝炎病毒蛋白质组学急慢性肝炎
- 乙型肝炎病毒在HepG2细胞中的稳定复制及表达
- 2007年
- 目的建立HBV HepG2肝细胞株,使HBV能长期稳定地表达抗原并复制。方法将含完整转录单位的1.2倍体HBV DNA经Sal (?)位点克隆入真核表达载体pREP10,构建的重组载体pREP-HBV以Lipofectamine2000转染HepG2细胞,250μg/mL潮霉素筛选抗性细胞克隆。ELISA检测细胞上清液中的HBsAg和HBeAg。电子显微镜下观察细胞上清液HBV颗粒。制备HBV特异性探针,以Southern印迹法检测细胞株内HBV核心颗粒DNA。结果获得含1.2倍体HBV DNA的重组载体,即pREP-HBV,该重组载体转染HepG2细胞后,获得5株潮霉素抗性细胞RHBV1～RHBV5,均能表达HBsAg和HBeAg。Southern印迹结果显示各株细胞均可见明显的杂交拖带,即存在HBV DNA复制中间体。细胞培养上清液浓缩后在电子显微镜下可见成簇的、直径约42 nm的HBV颗粒及直径为22～26 nm的球形颗粒。结论成功建立了HBV稳定复制及表达的HepG2细胞株,目前细胞已传代50次,每3天1次。
- 黄清玲柏世玉王林陈婉南林建银林旭
- 关键词：转染病毒复制
- B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白在果蝇细胞中的表达与纯化
- 2009年
- 目的获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)。方法PCR扩增获得B、C基因型乙型肝炎病毒X基因,以AgeⅠ及BglⅡ位点将其克隆入果蝇表达载体pMT/BiP/V5/HisC。重组载体与筛选质粒pCoBlast以脂质体Cellfectine共转染果蝇S2细胞,25μg/ml Blasticidin筛选多克隆抗性细胞株。扩增细胞以CuSO4诱导HBx蛋白表达,Western blot鉴定表达产物并确定最佳蛋白表达时间和诱导浓度。200 ml大规模培养细胞并诱导表达,一步法及两步法分别纯化B、C基因型HBx蛋白。结果成功构建重组表达载体pMT/BiP-HBxb(含B基因型HBx基因)和pMT/BiP-HBxc(含C基因型HBx基因)。在果蝇S2细胞中,B、C基因型HBx蛋白与6×His融合表达(分别为HBxb-His及HBxc-His),在CuSO4诱导后72 h以及诱导浓度为500μmol/L^1 mmol/L时蛋白表达量最高。在200 ml培养液中,一步法纯化所得HBxb-His及HBxc-His蛋白总量分别为1.52和1.37 mg,纯度为85.23%和84.59%;二步法所得的HBxb-His及HBxc-His蛋白总量分别为5.38和6.42 mg,纯度分别为95.36%和94.62%。结论在果蝇表达系统中表达并获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白,为进一步探讨结构和功能的关系奠定了基础。
- 郑瑾林万松林建银林旭
- 关键词：乙型肝炎病毒基因型纯化果蝇
