吉林省科技厅科技发展计划项目(2005136)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
- 相关作者：刘扬马淑梅刘晓冬汪海娇张洁琼更多>>
- 相关机构：吉林大学更多>>
- 发文基金：吉林省科技厅科技发展计划项目教育部留学回国人员科研启动基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- MDR1基因RNAi逆转录病毒载体的构建及表达被引量：1
- 2008年
- 目的:构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA(MDR1),并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法:根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Westernblotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果:重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转入MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDRmRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论:逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。
- 马淑梅刘扬刘晓冬
- 关键词：RNAI逆转录病毒载体乳腺癌
- HCT116-p53^(-/-)细胞中p53基因突变子模型的建立
- 2008年
- 目的:合成p53基因突变子及构建真核表达载体,并在HCT116-p53-/-细胞中建立248W和273H突变子表达模型,为研究p53突变子在肿瘤发生中的作用及通过封闭p53突变子的方法进行肿瘤基因治疗提供实验基础。方法:以野生型p53基因为模板,采用引物重叠PCR定点突变技术,合成p53基因248W和273H突变子,并利用基因重组技术构建出表达载体,用脂质体转染法建立模型,Western blotting检测p53突变子蛋白。结果:经基因测序后证实第248位密码子由精氨酸(CGG)突变为色氨酸(TGG),第273位密码子由精氨酸(CGT)突变为组氨酸(CAT),说明成功合成p53突变子,构建的表达载体转染HCT116细胞后,经Western blotting检测,以特异表达条带与内参GAPDH的比值做为相对值进行半定量比较,特异蛋白表达显著升高,证实模型建立成功。结论:通过引物重叠PCR定点突变技术成功构建p53基因248W和273H突变子,并在HCT116细胞中成功表达。
- 马淑梅汪海娇刘扬张洁琼施丹易贺庆吴丽珉刘晓冬
- 关键词：基因P53定点诱变BLOTTING
