国家自然科学基金(81000094)
- 作品数：8 被引量：13H指数：2
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- 敲低阿霉素心肌病大鼠心肌细胞ADAM10后大鼠心功能的改善及机制被引量：3
- 2018年
- 目的建立阿霉素心肌病动物模型,观察解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)小干涉RNA(siRNA)重组慢病毒对神经钙黏素(N-cadherin)加工水解途径的调控。方法 SD大鼠腹腔注射阿霉素,建立阿霉素心肌病大鼠模型。将ADAM10 siRNA重组慢病毒进行心内注射,分为模型组、重组慢病毒治疗组、空白载体组及正常对照组。分离原代心肌细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,确定感染效率。超声检测各组大鼠心功能,HE染色观察心肌组织病变情况,Western blot法检测心肌细胞N-cadherin在ADAM10水解后产生的C末端片段1(CTF1)的蛋白水平,免疫组织化学染色检测心肌组织N-cadherin的表达和分布。结果原代培养的感染后心肌细胞可见大量GFP表达,说明慢病毒成功感染心肌细胞;与阿霉素心肌病组相比,ADAM10 siRNA重组慢病毒治疗组死亡率下降,心功能及心肌组织形态明显改善,心肌细胞N-cadherin蛋白水平增加并主要定位于细胞表面、CTF1蛋白水平降低。结论敲低ADAM10水平,增加阿霉素心肌病大鼠心肌细胞N-cadherin的表达、降低CTF1的表达,改善心功能。
- 李小鸥谢莉莉何兵黄巍
- 关键词：阿霉素心肌病慢病毒
- ADAM17基因RNAi重组慢病毒的构建及鉴定
- 2018年
- 目的：研究解整合素金属蛋白酶-17（ADAM17）的特异性高效抑制剂,以控制炎症及其相关过程。方法：筛选确定ADAM17基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与慢病毒载体（GV115）连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。通过Western Blot检测细胞ADAM17的蛋白表达。用重组慢病毒转导脂多糖（LPS）刺激的U937细胞,观察重组慢病毒在蛋白质水平上对ADAM17的表达和活性的影响。结果：成功构建了ADAM17RNAi重组慢病毒,并能显著抑制ADAM17的蛋白表达,减少sTNF-α分泌。结论：ADAM17RNAi重组慢病毒降低了sTNF-α的分泌,对炎症有明显的抑制作用,为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法。
- 何兵李小鸥庹虎张明霞万俊华
- 关键词：RNA干扰ADAM17肿瘤坏死因子Α炎症
- ADAM17基因RNAi重组慢病毒对小鼠内毒素血症的抑制作用被引量：1
- 2018年
- 目的：建立小鼠内毒素血症模型,观察ADAM17shRNA的重组慢病毒对炎症的抑制作用,为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法：将ADAM17shRNA的重组慢病毒作用于小鼠内毒素血症模型,通过流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞mTNF-α的表达,并取肝、肺、肾组织行HE染色,观察重组慢病毒对炎症的抑制作用。结果：动物实验证明重组慢病毒组小鼠腹腔巨噬细胞膜表面mTNF-α增加,常规病理切片HE染色显示该慢病毒可降低LPS诱发的小鼠肝、肾、肺组织的炎症反应。结论：ADAM17重组慢病毒降低了sTNF-α的分泌,对炎症有明显的抑制作用,为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法。
- 何兵庹虎连文静李小鸥
- 关键词：RNA干扰ADAM17肿瘤坏死因子Α
- 封闭N-cadherin解整合素金属蛋白酶水解位点的单链抗体的制备及鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的制备封闭神经型钙黏素(N-cadherin)解整合素金属蛋白酶水解位点(ADAM)的单链抗体(scFv),并进行鉴定。方法首先利用RT-PCR技术从分泌抗N-cadherin的ADAM水解位点单克隆抗体(mAb)细胞株中扩增出重链(V_H)和轻链(V_L)可变区基因片段,然后通过重叠延伸PCR法(SOE-PCR),构建成scFv基因片段。再将其克隆入原核表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中诱导表达,通过镍柱纯化和复性后,用SDS-PAGE、ELISA和Western blot法等测定重组蛋白的生物学活性。结果PER、酶切和测序表明scFv片段长744 bp,编码248个氨基酸。scFv基因表达载体转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达出相对分子质量(M_r)约29 000的目的蛋白,主要为包涵体形式,经变性,纯化和复性后,获得纯度达90%以上的scFv蛋白,ELISA和Western blot法检测表明可溶性scFv可以与N-cadherin的ADAM水解位点序列多抗原短肽和全长N-cadherin结合。结论成功构建并表达封闭N-cadherin的ADAM加工位点单链抗体。
- 李小鸥黄巍李莉周丽荣
- 关键词：ADAM10N-CADHERIN单链抗体基因表达
- 解整合素金属蛋白酶10基因慢病毒载体的构建及鉴定
- 2013年
- 目的:构建解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体,为进一步体内外实验研究提供基础。方法:筛选确定ADAM10基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,与LentiLox3.7载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用重组慢病毒转导传代心肌细胞(H9C2),通过Western blotting检测心肌细胞ADAM10的蛋白表达。结果:获得的载体插入ADAM10的shRNA核苷酸链序列正确,包装的慢病毒颗粒转导心肌细胞,与对照组比较ADAM10 shRNA转染成功抑制ADAM10蛋白表达。结论:成功构建AD-AM10 shRNA慢病毒载体,为其在扩张型心肌病(DCM)中的生物学功能研究奠定基础。
- 李小鸥黄巍何兵周丽荣
- 关键词：RNA干扰慢病毒扩张型心脏病
- 支气管肺泡灌洗液炎性因子及肺泡表面活性蛋白与新生儿急性呼吸窘迫综合征的关系被引量：6
- 2022年
- 目的观察急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)新生儿支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)炎性因子、肺泡表面活性蛋白(surfactant protein,SP)水平变化,探讨其与新生儿发生ARDS的相关性。方法需机械通气的ARDS新生儿30例为ARDS组,根据氧合指数分为轻度组(氧合指数4.0~<8.0)11例,中度组(氧合指数8.0~<16.0)12例,重度组(氧合指数≥16.0)7例;因其他疾病需机械通气新生儿25例为对照组。比较ARDS组与对照组应用肺表面活性物质、脓毒症、窒息比率及机械通气时间等。ARDS组于呼吸机上机前、上机24 h时、撤机前,对照组于呼吸机上机前收集BALF,采用ELISA法检测BALF白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、SP-A、SP-D水平;比较上机前ARDS组与对照组及ARDS组上机前、上机24 h时、撤机前BALF IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、SP-A、SP-D水平,比较轻、中、重度组上机24 h时BALF IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、SP-A、SP-D水平。采用Pearson相关分析ARDS新生儿上机24 h时BALF SP-A水平与IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α水平的相关性;采用多因素logistic回归分析新生儿发生ARDS的影响因素。结果ARDS组应用肺泡表面活性物质、脓毒症、窒息比率(86.67%、40.00%、46.67%)均高于对照组(20.00%、4.00%、8.00%)(χ^(2)=6.857,P<0.001;χ^(2)=7.329,P<0.001;χ^(2)=8.968,P<0.001),机械通气时间[(4.20±1.50)d]长于对照组[(1.00±0.20)d](t=2.432,P=0.004)。上机前ARDS组BALF IL-6[(198.32±10.23)ng/L]、IL-17[(118.42±73.55)ng/L]、TNF-α[(52.63±9.77)ng/L]水平均高于对照组[(125.61±10.39)、(98.03±54.91)、(42.67±15.31)ng/L](P<0.05),SP-A[(38.96±1.24)ng/L]、SP-D[(9.71±0.07)ng/L]水平均低于对照组[(45.95±1.87)、(12.62±0.05)ng/L](P<0.05),IL-10水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。上机24 h时ARDS组BALF IL-6、IL-17、TNF-α水平均高于上机前、撤机前(P<0.05),SP-A、
- 李小鸥黄红丽方成志
- 关键词：急性呼吸窘迫综合征支气管肺泡灌洗液炎性因子
- ADAM10真核表达载体的构建及其对MCF-7增殖迁移的影响被引量：1
- 2012年
- 目的构建ADAM10真核表达载体,观察稳定转染乳腺癌细胞MCF-7后对其增殖和迁移的影响。方法利用PCR技术扩增人ADAM10的基因片段,克隆入pcDNA3.1真核表达载体,阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定。脂质体法将重组质粒转染MCF-7细胞,通过G418筛选出稳定转染ADAM10的细胞株,通过Western blot检测细胞ADAM10的表达,通过MTT法和Transwell法分别检测细胞的增殖和迁移变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明ADAM10真核表达载体构建成功,Western blot结果显示稳定转染细胞的ADAM10蛋白高表达,MTT实验显示转染细胞增殖速度稍快于对照(P<0.05),Transwell结果显示转染细胞迁移能力比对照强(P<0.01)。结论成功构建ADAM10真核表达载体,稳定转染MCF-7细胞后可增强细胞的增殖和迁移,为进一步研究ADAM10生物学作用奠定基础。
- 黄巍李小鸥周丽荣黄晓刚刘桥
- 关键词：MCF-7细胞细胞迁移
- ADAM10基因RNA干扰重组慢病毒的转导对H9C2细胞N型钙粘蛋白的解整合素金属蛋白酶10加工途径的影响被引量：1
- 2013年
- 目的构建ADAM10基因RNA干扰重组慢病毒，观察其在N型钙粘蛋白底物加工过程中的重要性，为探求该加工途径在维持心肌组织结构形态和完整性中的作用打下基础。方法筛选确定ADAM10基因RNA干扰有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，与LentiLox3．7载体连接，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。用重组慢病毒转导心肌细胞（H9C2），通过Westernblotting检测心肌细胞N型钙粘蛋白及其C-端的CTFl片段的蛋白表达，流式细胞学实验检测N型钙粘蛋白在心肌细胞表面的表达，利用黏附实验检测转染前后心肌细胞黏附能力的变化。结果成功构建ADAM10shRNA慢病毒载体，包装慢病毒，转导心肌细胞。与阴性对照组相比，转染组心肌细胞N型钙粘蛋白表达提高，CTF1片段表达减少；细胞表面N型钙粘蛋白的表达增多；心肌细胞黏附能力提高。结论初步证明心肌细胞中ADAMIO在N型钙粘蛋白的加工水解过程中发挥重要作用，为进一步明确该水解途径在维持心肌细胞形态结构和完整性方面所起的作用打下了实验基础。
- 李小鸥黄巍周丽荣
- 关键词：RNA干扰ADAM10慢病毒
