国家高技术研究发展计划(2007AA02Z473)
- 作品数：18 被引量：34H指数：4
- 相关作者：师长宏赵勇毛峰峰赵善民张海更多>>
- 相关机构：第四军医大学第四军医大学西京医院大连大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金陕西省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力被引量：1
- 2012年
- 目的:测定表达肝素结合血凝素(HBHA)和人白细胞介素12(hIL-12)融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答及对结核分枝杆菌感染的保护作用。方法:将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免疫小鼠,检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表达水平;用结核分枝杆菌感染免疫小鼠,检测小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。结果:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量增加为主的Th1型免疫应答,并能有效减少感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量和病理损伤。结论:表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠可诱导产生与卡介苗相当的保护作用,可能成为控制结核病的有效疫苗。
- 赵善民赵勇张彩勤毛峰峰白冰张海师长宏徐志凯
- 关键词：耻垢分枝杆菌肝素结合血凝素人白细胞介素12保护力
- 表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用被引量：4
- 2012年
- 评价表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌用于结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗效果。结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠4周后,用表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫治疗,检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。重组耻垢分枝杆菌可有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量,减轻病理损伤。但在降低肺部荷菌量方面不如化疗药物。表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖,可能成为联合化疗药物控制结核病的有效候选疫苗。
- 赵善民张彩勤赵勇毛峰峰白冰张海师长宏徐志凯
- 关键词：重组耻垢分枝杆菌结核分枝杆菌HBHA
- 结核分枝杆菌的耐药基因及其相关分子机制被引量：4
- 2011年
- 结核分枝杆菌原发性和继发性耐药是当前控制和治疗结核病面临的重要问题,随着分子遗传学的发展,已经阐明了结核分枝杆菌耐药的分子基础是染色体的突变,影响了药靶本身或激活了药物前体的细菌酶,造成MTB的耐药。本文主要就MTB对其常用药物的耐药机制展开讨论,以便正确认识MTB对不同药物的耐药机制,建立快速检测耐药结核分枝杆菌基因型的分子生物学方法。
- 伍静师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌耐药分子机制耐药基因
- 结核分枝杆菌Rv1759c结构域与IL-2融合蛋白的表达与鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的:构建结核分枝杆菌(MTB)Rv1759c结构域(Rv1759cD domain,Rv1759cD)与人IL-2(hIL-2)融合基因,并在大肠杆菌中表达获得重组的融合蛋白Rv1759cD-IL-2。方法:用PCR方法从MTB H37Rv基因组扩增Rv1759cD基因片段,测序后与hIL-2基因构建融合基因,并克隆到表达载体pProEX HTa。融合基因在大肠杆菌DH5α中诱导表达,经SDS-PAGE分析后,分别与His mAb、IL-2mAb和结核病人血清进行Western-blot鉴定,采用Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。结果:获得的Rv1759cD基因经测序与GenBank公布的序列完全一致,与hIL-2基因连接后,构建的融合基因在大肠杆菌中有效表达。表达蛋白相对分子量为30KDAa,与预测值相符;Western-blot结果显示,在相对分子量30KDAa处分别与His mAb和鼠抗IL-2 mAb形成结合带,并与结核病人血清出现特异性结合。通过Ni-NTA亲和层析,可得到纯化的目的蛋白。结论:成功表达、纯化和鉴定了Rv1759cD-IL-2融合蛋白,并有可能作为新型结核病疫苗的靶抗原。
- 师长宏江鹰毛峰峰赵勇张彩勤赵善民白冰陈涛
- 关键词：结核分支杆菌IL-2
- 复苏促进因子结合蛋白A的原核表达及对耻垢分枝杆菌的促生长作用被引量：2
- 2010年
- 目的:在大肠埃希氏菌中表达结核分枝杆菌复苏促进因子结合蛋白A(resuscitation-promoting factor-interacting protein A,RipA),观察该蛋白对耻垢分枝杆菌的促生长作用。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv的DNA中扩增出编码RipA蛋白的Rv1477基因,测序正确后克隆入原核表达载体pProEx HTa,构建重组表达质粒pProEx HTa-RipA。以重组质粒转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性重组菌株,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IPTG)诱导RipA表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的RipA蛋白加入到耻垢分枝杆菌中,分光光度法测定细菌的A600,观察RipA蛋白的促生长作用。结果:成功扩增了Rv1477基因,并克隆于表达载体pProEx HTa中,经酶切鉴定获得阳性克隆。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子量为52kDa的目的蛋白,Western-blot结果显示该蛋白与6×His单抗有特异性的反应条带。采用Ni+-NTA柱可获得纯化的目的蛋白。100pM的RipA蛋白可显著促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和生长。结论:RipA蛋白在大肠杆菌中成功表达,并能有效促进耻垢分枝杆菌的生长。
- 师长宏赵勇毛峰峰张海白冰江鹰
- 关键词：结核分枝杆菌休眠
- 结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中。分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高。结论成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础。
- 赵勇张海赵善民伍静毛峰峰郭晓雅张彩勤师长宏
- 关键词：HBHA耻垢分枝杆菌重组疫苗
- 结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6的表达、纯化和鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的:克隆结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出ESAT-6基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAGE及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果:成功克隆了ESAT-6基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western-blot分析表明表达产物正确。通过GST纯化系统获得34kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论:成功获得了纯化的ESAT-6蛋白,为进一步研究ESAT-6蛋白的致病机理提供了实验依据。
- 季林赵勇毛峰峰赵善民张彩勤白冰师长宏
- 关键词：结核分枝杆菌ESAT-6纯化
- 抗结核分枝杆菌RpfB结构域单克隆抗体的制备及鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的:制备抗结核分枝杆菌Rpf B结构域单克隆抗体。方法:将p PRO-EXHT-Rpf B domain原核表达载体接种于大肠杆菌DH5中,用IPTG诱导表达Rpf B结构域蛋白,以纯化的Rpf B结构域蛋白作为免疫原,皮下包埋免疫小鼠3次,每次间隔2周;分离小鼠的脾细胞,与Sp2/0细胞融合,克隆化制备抗Rpf B结构域单抗,ELISA检测其效价,鉴定其特异性和相对亲和力,观察制备的抗Rpf B结构域单抗对Rpf家族其他蛋白的识别能力及其对结核分枝杆菌和藤黄微球菌的生长抑制作用。结果:制备了3株抗Rpf B结构域单抗,特异性高,亲和力较强,均能特异性识别Rpf B结构域。经小鼠腹腔注射制备腹水并纯化,获得了较高纯度的单抗,所制备的抗Rpf B结构域多肽的单克隆抗体可以识别多种Rpf样蛋白及其结构域蛋白。在抗体滴度为1∶1000时可有效抑制Rpf B结构域对结核分枝杆菌H37Ra和藤黄微球菌的生长促进作用,提示抗Rpf B结构域单抗可能会抑制进入机体内生长停滞或潜伏感染的结核分枝杆菌的再次激活,可能具有预防隐性感染复发的作用。结论:抗Rpf B结构域单抗的制备为进一步研究Rpf B结构域的生物学和免疫特性提供了实验工具。
- 樊爱琳马越云郑善銮杨麦贵郝晓柯
- 关键词：结核分枝杆菌单克隆抗体
- 藤黄微球菌Rpf及其结构域蛋白对结核分枝杆菌生长的影响
- 2009年
- 目的表达纯化藤黄微球菌（Micrococcus luteus）复活促进因子（Rpf）及结构域（domain）蛋白，研究其对结核分枝杆菌生长的影响。方法诱导表达含有藤黄微球菌Rpf及其结构域基因的融合表达载体pPro-EXHT—Rpf和pPro—EXHT-Rpf domain，在变性条件下对目的蛋白进行纯化。用不同浓度的纯化蛋白刺激不可培养状态结核分枝杆菌的生长。结果获得藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白的纯度分别为95％和93％，相对分子质量（Mr）大小分别为30×10^3和12×10^3，蛋白质含量分别为471mg／L和337ms／L。Western blot证实，获得的蛋白为我们所需要的目的蛋白。所获得的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白能够促进不可培养状态的结核分枝杆菌的生长，而抗藤黄微球菌Rpf结构域的单克隆抗体可以明显抑制结核分枝杆菌的生长。结论表达的藤黄微球菌Rpf及其结构域融合蛋白可以促进结核分枝杆菌的生长，而且藤黄微球菌Rpf蛋白与Rpf结构域蛋白具有一致的生物活性。
- 樊爱琳简文郑善銮师长宏马越云杨麦贵柏银兰徐志凯郝晓柯
- 关键词：藤黄微球菌结核分枝杆菌结构域
- 重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG休眠菌的促生长作用被引量：4
- 2010年
- 目的观察重组结核分枝杆菌RpfE蛋白对BCG的促生长作用。方法将测序正确的Rv2450c基因克隆到表达载体pET32a(+)中,获得RpfE蛋白,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的蛋白分别与结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗进行Western blot分析。分别将10pmol/L和100pmol/L的RpfE加入到休眠BCG的培养基中,观察RpfE蛋白对BCG的促生长作用。结果得到融合组氨酸残基的重组RpfE蛋白,Western blot结果显示该蛋白分别与活动期结核病人血清,Rpf单抗和Rpf结构域单抗在40kDa处发生反应。100pmol/L的RpfE蛋白对BCG休眠菌具有明显的复苏和促生长作用。结论构建了MtbRv2450c基因的重组表达载体,纯化获得了RpfE重组蛋白,该蛋白对BCG休眠菌具有复苏和促生长作用。
- 郭晓雅师长宏史皆然张海赵勇邵成
- 关键词：结核分枝杆菌促生长作用
