国家自然科学基金(30270981)
- 作品数：12 被引量：56H指数：4
- 相关作者：王志亮吴晓东刘雨田刘海生袁志栋更多>>
- 相关机构：农业部动物检疫所南京农业大学江西农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金青岛市自然科学基金项目引进国际先进农业科技计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 绵羊PrP前体蛋白基因真核表达载体的构建及汉逊酵母中的初步表达
- 2008年
- 根据已知的绵羊PRNP基因序列设计引物,扩增出完整的PrP前体蛋白基因,将获得的基因克隆到pGEM-T载体中,得到插入PrP前体蛋白基因的pGEM-T-OPrP质粒,经PCR、酶切、测序鉴定后,用EcoRI和NotI从pGEM-T-OPrP上切下目的片段后,连接到汉逊酵母表达载体pFMDHZ-α-A中,通过PCR、酶切、插入鉴定保证正确插入后,经电转化将重组质粒pFMDHZ-α-A-OPrP转入多形汉逊酵母中,随后通过甲醇诱导进行表达。本研究表达的绵羊PrP前体蛋白,为绵羊痒的检测及诊断、PrP的结构与功能研究奠定基础。
- 兰邹然王志亮赵永刚李金明吴晓东
- 关键词：PRP前体蛋白多形汉逊酵母
- 单抗介导牛海绵状脑病免疫组化检测方法的建立及其应用被引量：8
- 2005年
- 中国鲁西黄牛重组 PrPc成熟蛋白免疫 PrPc基因敲除小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,经免疫组织化学试验筛选出单抗4C11可特异识别牛海绵状脑病标准阳性牛脑样品上PrPSc核心片段。以单抗4C11为核心试剂,建立了单抗介导牛海绵状脑病免疫组织化学检测方法,并已颁布成为中华人民共和国国家标准 GB/T19180-2003(牛海绵状脑病诊断技术)。已应用于中国牛海绵状脑病的持续监测,至 2002 年底共检测了全国各地 3344 份牛脑样品,结果全为阴性,且每批次所设的阳性对照样品检测结果均呈阳性,与 Roche 公司单抗 6H4 检测结果的符合率为 100%。
- 王志亮吴晓东刘雨田邹艳丽鲍恩东王长杰
- 关键词：单抗免疫组化检测牛海绵状脑病免疫组织化学检测阴性牛脑
- 水牛朊蛋白成熟片段基因的克隆与原核表达被引量：4
- 2006年
- 目的克隆、分析水牛朊蛋白(prionprotein,PrP)成熟片段基因,并获取纯化的表达产物。方法将应用PCR技术扩增的水牛成熟PrP的核酸序列克隆到表达载体pET-32a,并分析其序列;把阳性克隆质粒pET-32a-BPrP转化表达菌BL21(DE3),鉴定纯化的表达产物。结果水牛朊蛋白成熟片段核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其他牛科动物的成熟PrP核酸、氨基酸序列间的相似性分别在97.1%和97.2%以上,并且发现水牛成熟PrP有5个重复序列,编码的氨基酸序列其中有2个九肽和3个八肽重复序列。具有较高的表达水平的PrP融合蛋白被纯化后,用Western印迹实验证明该蛋白具有PrP抗原活性。结论首次报道了克隆、分析水牛朊蛋白成熟片段基因,发现水牛成熟PrP有5个重复序列,并获得了具PrP抗原活性的水牛成熟PrP融合蛋白。
- 袁志栋王志亮刘雨田吴晓东赵永刚刘海生
- 关键词：克隆原核表达
- 免疫组织化学方法检测牛海绵状脑病(BSE)和羊痒病(Scrapie)
- 2004年
- 按照本实验室建立的牛海绵状脑病免疫组织化学方法 ,将自制单克隆抗体4C11与PK酶消化处理的牛海绵状脑病阳性切片和羊痒病阳性切片进行反应 ,发现单抗4C11不仅能与牛海绵状脑病阳性切片发生强烈的免疫反应 ,而且也能与羊痒病阳性切片发生强烈的免疫反应。从阳性切片和阴性切片的实验来看 ,单克隆抗体4C11没有非特异性染色反应 ,并且也没有背景染色。用瑞士进口单抗6H4进行的对照实验获得了同样的结果。因此 ,可以用自制的单克隆抗体4C11替代昂贵的进口单抗6H4来监测我国的牛海绵状脑病和羊痒病。
- 刘雨田吴晓东邹艳丽王志亮
- 关键词：免疫组织化学方法牛海绵状脑病BSE羊痒病SCRAPIE
- 两种PrP截短型多肽的神经毒性
- 2005年
- PrP106～126和PrP118～135分别对应于人PrPC序列中106～126残基和118～135残基,两个肽段在试验中具备PrPSc的部分病理特症,因此PrP106～126和PrP118～135就成为了研究PrPSc神经细胞毒性致病机制的合适的模型。
- 袁志栋王志亮刘雨田吴晓东刘海生
- 关键词：神经细胞毒性
- 抗PrP单抗用于BSE检测和PrPC在CNS中的定位和分布
- 朊病毒病(又称传染性海绵状脑病)的病原是致病型朊蛋白(PrPSc),聚集在牛脑中能够引发牛海绵状脑病(BSE).利用自制的单抗4C11和国外同类单抗进行免疫组织化学(IHC)的比较染色,结果显示单抗4C11和国际上常用的...
- 王小军王志亮鲍恩东刘雨田吴晓东
- 关键词：朊蛋白朊病毒牛海绵状脑病
- 文献传递
- 与朊毒体相关的鱼类朊蛋白研究概况
- 2006年
- 疯牛病(mad cow disease),即牛传染性海绵状脑病(bovine transmissible spongiform encephalopathy,BSE)的俗称,是一种慢性消耗性、致死性、中枢神经系统退行性疾病。疯牛病被认为与朊毒体(Prion)有关,朊毒体是由正常朊蛋白(Prion protein,或者PrPC)发生构象改变后形成的异常蛋白(PrPSc)。疯牛病的发生引起了世界各国政府和科学界的高度重视,PrP的起源及其功能研究已成为研究热点。鱼类PrP相关蛋白的研究正在展开中,由于鱼类PrP相关蛋白与朊蛋白的结构相似,鱼类感染TSE类似病存在理论上的风险。本文全面地综述了疯牛病的概况、朊毒体的特性、朊毒体与哺乳动物朊蛋白、鱼类PrP相关蛋白(PrP1、PrP2和PrP3)及鱼类其他PrP相关蛋白的研究情况,为国内水生动物PrP相关蛋白研究提供参考。
- 兰邹然王志亮张学成
- 关键词：鱼类
- 绵羊ARQ基因型PrP前体蛋白基因的克隆及原核表达
- 2006年
- 目的构建ARQ基因型PrP前体蛋白基因原核表达重组质粒,为TSE的检测及诊断、PrP的结构与功能研究奠定基础。方法根据GenBank中绵羊PrP基因全序列和表达载体pET28a载体的多克隆位点设计了绵羊PrP前体蛋白基因引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增绵羊PrP前体蛋白基因,通过酶切将些基因克隆到pET28a(+)载体中,构建了重组原核表达质粒pET-OPrP。重组质粒转化E.coliBL-21感受态细胞,用IPTG诱导表达,通过PAGE电泳和Western-blo-ting鉴定表达的重组蛋白。结果在pET28a(+)载体中成功克隆了PrP前体蛋白基因,并在E.coli中成功表达了重组的PrP前体蛋白。结论绵羊PrP前体蛋白基因可以在E.coli中表达。本次克隆得到的小尾寒羊的PrP基因型为ARQ。
- 兰邹然王志亮张学成赵永刚吴晓东
- 关键词：PRP前体蛋白
- 水貂朊蛋白前体基因的原核表达被引量：4
- 2005年
- 构建了水貂朊蛋白前体基因的表达载体,所筛选出的阳性克隆质粒经转化表达菌BL21(DE3)后,收获表达菌,纯化鉴定表明获得了目的产物.
- 袁志栋王志亮刘雨田吴晓东刘海生
- 关键词：克隆原核表达
- PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成份种类被引量：25
- 2004年
- 为防范疯牛病传入我国,有必要鉴别肉骨粉中动物成份的种类。针对牛、羊、猪和鸡四种动物的特异性核苷酸序列,分别选用和设计了四对特异性引物,用试剂盒提取四种动物的肉骨粉或者处理过的肉组织中的DNA,然后进行PCR扩增,所扩增的目的片断大小分别为271bp、199bp、196bp、148bp,运用PCR技术建立了鉴定这四种动物源性成分的方法。结果分别扩增出四种动物的特异性条带,证明该PCR方法具有很高的特异性和敏感性,而且成本低廉,简便易行,因此可以作为鉴别肉骨粉种类的常规方法。
- 李林徐江涛张永强王志亮
- 关键词：PCR方法肉骨粉牛海绵状脑病人畜共患病
