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细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒被引量：18: 2004年; 目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。; 王家宁黄永章孔霞郭凌郧; 关键词：细菌同源重组 Β-半乳糖苷酶重组腺病毒基因治疗

体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体: 2006年; 目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒,回收4.6 kb的LacZ基因表达盒,与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接,连接产物用SwaⅠ酶切,最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后,用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsC l密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312 bp特异性条带,PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Ad-eno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法,本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础,Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。; 王家宁王传成郭凌郧黄永章; 关键词：腺病毒 Β-半乳糖苷酶

HIF-2α、VEGF与肾细胞癌血管生成、癌转移的关系被引量：2: 2004年; 目的　探讨缺氧诱导因子 -2α(Hypoxiainduciblefactor -2α ,HIF -2α)、血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfac tor ,VEGF)在肾细胞癌中的表达及其与血管生成、癌转移的关系。方法　应用免疫组织化学技术检测 48例肾细胞癌中HIF -2α、VEGF的表达。结果　 48例肾细胞癌HIF -2α阳性率为 70 8%,强表达 12例 ,中度表达 10例 ,弱表达 12例 ,无表达 14例 ,与正常对照组比较有显著性差异 (P <0 0 1)。Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ～Ⅳ级VEGF阳性细胞数三组比较有显著性差异 (P <0 0 1)。患者癌转移者与无癌转移者HIF -2α、VEGF比较有显著性差异 ( P <0 0 1) ,HIF -2α表达与肾细胞癌恶性程度呈正相关 (r =0 682 ,P <0 0 1)。VEGF与HIF -2α表达呈正相关 (r =0 72 2 ,P <0 0 1)。结论　HIF -2α与VEGF有相关性 ,HIF -2α、VEGF与血管生成、癌转移有关 ,HIF; 孔鹏黄文立刘银凤曾进叶章群; 关键词：缺氧诱导因子-2Α 肾细胞癌血管生成癌转移

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湖北省自然科学基金(2000J056)