北京市自然科学基金(09G0013)
- 作品数：6 被引量：4H指数：2
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- 5-HT_(1A)受体蛋白在PC12细胞膜转运的动态变化
- 2010年
- 目的在神经元样PC12活细胞上进行实时、可视和定量研究5-羟色胺1A受体的时空分布、膜转运和信号传导机制。方法运用RT-PCR方法获得小鼠5-HT1A基因,并插入到pEGFP-N1真核表达载体中。采用阳离子脂质体方法将质粒转染至PC12细胞和HEK293细胞中,通过G418筛选出稳定表达5-HT1A-EGFP的PC12细胞系。运用激光共聚焦成像系统观察活细胞中5-HT1A-EGFP的表达情况,利用光漂白荧光恢复(FRAP)技术在PC12细胞膜局部漂白后观察5-HT1A-EGFP荧光蛋白在细胞膜上转运的情况。结果克隆所获得的小鼠5-HT1A基因是准确的。5-HT1A-EGFP蛋白清晰的分布于PC12和HKE293细胞膜上。通过FRAP技术观察到漂白区域的细胞膜在100s内有部分恢复,说明受体在细胞膜上发生转运。结论建立了稳定表达5-HT1A-EGFP融合蛋白的PC12细胞系,并利用活细胞成像和FRAP技术观察分析并证实了5-HT1A受体在PC12细胞的膜表面的表达和转运的动态变化。
- 金艳燕吕琼闫竹青高尔静赵春礼张进禄徐志卿
- 甘丙肽抑制大鼠垂体腺瘤细胞体外侵袭性被引量：2
- 2011年
- 目的探讨甘丙肽对大鼠垂体腺瘤细胞侵袭性的作用及其受体机制。方法提取大鼠垂体腺瘤GH3细胞RNA,反转录后测定甘丙肽及其3个受体亚型的表达情况;将大鼠垂体腺瘤GH3细胞分为对照组、甘丙肽药物处理组和选择性甘丙肽2型受体激动剂AR-M1896组,利用MTT方法检测对照组和实验组在给药后12、24和36 h各分组细胞活力,观察其增殖情况;应用Transwell侵袭模型观察各组腺瘤细胞侵袭能力。结果甘丙肽与其3个受体亚型在大鼠垂体腺瘤GH3细胞中均有表达,其中以受体2表达量较高;各组细胞在药物处理12、24和36 h时细胞增殖无显著差异;GH3细胞Transwell侵袭实验中甘丙肽药物组侵袭细胞数量明显少于对照组(P<0.01);甘丙肽受体激动剂AR-M1896组与对照组相比腺瘤细胞侵袭性明显降低(P<0.05);AR-M1896与甘丙肽对GH3细胞的抑制效果差异无显著性。结论甘丙肽能明显抑制大鼠垂体腺瘤细胞的侵袭性,且此作用可能主要由甘丙肽2型受体介导。
- 马克乾孙静李杰闫竹青鲁润春贾旺徐志卿
- 关键词：脑垂体腺瘤侵袭性甘丙肽GH3细胞
- 小鼠甘丙肽1型受体在HEK293A细胞中的表达和内化
- 2011年
- 目的:克隆小鼠甘丙肽1型受体(mGalR1)基因,构建其真核表达载体,并观察该基因在HEK293A细胞中的表达和内化。方法:应用RT-PCR方法,以小鼠下丘脑RNA为模板,扩增获得甘丙肽I型受体(mGalR1)基因并定向克隆到pEGFP-N1真核表达载体;mGalR1-pEGFP表达载体瞬时转染HEK293A细胞,利用激光共聚焦显微技术观察mGalR1在给予甘丙肽(10-7mol/L)0、5、10、15min刺激时的内化情况。结果:克隆得到正确的mGalR1基因全长序列,其cDNA为1 047bp,共编码348个氨基酸;共聚焦显微镜结果表明mGalR1主要在膜上表达,经甘丙肽刺激5～15min后受体下膜进入胞浆。结论:成功构建真核表达载体mGalR1-pEGFP并在HEK293A中表达;在甘丙肽刺激下小鼠甘丙肽1型受体存在内化现象。
- 李晓晓徐舒李慧宫夏霓徐志卿
- 关键词：真核表达载体内在化
- 甘丙肽2型受体在HEK293A细胞中的同源二聚化研究被引量：2
- 2011年
- G蛋白偶联受体二聚化在受体的转运和信号转导中起着重要的调节作用。为了验证甘丙肽2型受体(GalR2)是否形成同源二聚体,本实验分别构建了N端带FLAG和HA标签的GalR2融合蛋白,并转染到HEK293A细胞中。Western blot发现,除了相当于GalR2分子量的位置有条带之外,在大约2倍于GalR2分子量的位置也有条带,提示GalR2可能是以二聚体的形式存在的。共转染HA-GalR2和FLAG-GalR2,通过免疫共沉淀方法,在抗HA的免疫片段中检测到了FLAG的免疫活性,且在相当于单倍分子量和二倍分子量上均有条带;反过来,在FLAG的免疫片段中检测HA的免疫活性,条带同样出现在单倍分子量和二倍分子量上。以上结果表明甘丙肽2型受体之间形成了同源二聚体。
- 闫竹青吕琼金艳燕李杰马克乾杨予涛徐志卿张进禄
- 关键词：G蛋白偶联受体同源二聚体免疫共沉淀
- 人甘丙肽2型受体基因启动子的克隆与初步功能分析
- 2011年
- 人甘丙肽2型受体(GalR2)作为G蛋白偶联受体,其功能已被广泛研究,但GalR2基因的转录调控机制尚不明确。我们利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法扩增人GalR2基因上游1121 bp的片段,再通过PCR方法将其缺失成3段长度不等的片段,然后分别将其克隆到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,并将相应的质粒命名为pGL3-B-1121、pGL3-B-922、pGL3-B-521和pGL3-B-200;通过荧光素酶活性分析检测不同长度的GalR2基因启动子在人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)中的活性,发现GalR2基因上游1121 bp区段具有明显的转录活性,缺失-1121到-922 bp区域引起启动子活性的明显增高,暗示该区域存在负调控元件;利用TESS在线软件分析GalR2基因上游序列,发现该基因启动子含有Sp1、AP-1、AP-2、NF-1、YY1和ERα等多种顺式作用元件。因此,本实验初步确定了人GalR2基因启动子的转录调节区,为进一步研究该基因转录调控机制奠定了基础。
- 李杰杨予涛马克乾闫竹青李晓晓赵春礼徐志卿
- 关键词：启动子转录调节
- 甘丙肽2型受体在HEK293细胞中的表达及内化过程被引量：3
- 2010年
- 构建了在甘丙肽2型受体(GalR2)N端带myc表位标签的真核表达载体,并将其转染到HEK293细胞,进而应用免疫荧光细胞化学方法结合激光扫描共聚焦显微技术观察GalR2蛋白的亚细胞分布和膜转运过程。Western blot结果发现转染组myc-GalR2蛋白水平呈高表达。myc-GalR2主要分布在细胞膜上,少量分布于胞浆中。当给予甘丙肽(10-7mol/L)刺激后,5min时可见细胞膜上myc-GalR2明显减少,胞浆内myc-GalR2增多,15min时膜上myc-GalR2几乎全部消失。表明GalR2受体与配体结合后发生内化,且受体蛋白内化为时间依赖性的转运过程,证实在HEK293细胞GalR2会出现配体依赖性内化。同时,以已知膜蛋白5-HT1AR的内化作为对照,可见在给予甘丙肽刺激以后,5-HT1AR没有发生内化,受体蛋白仍然表达在膜上。此外,通过测定胞内钙水平激活情况来检测其信号通路激活情况,表明myc对GalR2功能没有明显影响。
- 吕琼金艳燕吴波路雅静李晓晓赵春礼徐志卿
- 关键词：HEK293细胞
