广东省自然科学基金(8151051501000057)
- 作品数：5 被引量：12H指数：2
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- CD133^+人脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定
- 2012年
- 目的从人脐带血中分选出CD133+造血祖细胞,并进行长时间干性维持培养。方法通过免疫磁珠法分选出人脐带血中的CD133+造血祖细胞,经流式细胞仪检测免疫磁珠分选后的CD133+造血祖细胞。采用五种方法扩增培养该细胞,8周后,再通过细胞形态学、流式细胞术、免疫细胞化学和免疫荧光对细胞进行干性鉴定,探索最佳干性维持培养方法。结果通过免疫磁珠法可以从人脐带血中分选出80%以上的CD133+造血祖细胞。采用优化的无血清培养基培养8周之后,CD133+造血祖细胞可得到有效扩增。而其他的培养基会使CD133+造血祖细胞由半悬浮细胞分化为梭形贴壁细胞,并且细胞状态欠佳。结论利用免疫磁珠法分选出的CD133+造血祖细胞,采用优化的无血清培养基能够有效扩增该细胞,并可长期有效的维持其干性。
- 吴小金陈芳陆滟霞杨慧彭璠莉袁理刘国炳李学农
- 关键词：人脐血造血祖细胞干性
- 靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定被引量：5
- 2011年
- 目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞表面标记物CD133细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133的特异性短肽。应用夹心ELISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果 4轮液相筛选后,与CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA鉴定的20个噬菌体单克隆中,有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子的高亲和力多肽的方法切实可行。
- 田平阁周春平张超杨慧吴小金陆滟霞刘国炳李学农
- 关键词：CD133噬菌体展示肽库
- 转移相关miRNAs在肿瘤转移中的作用被引量：5
- 2012年
- 微小RNA(microRNA,miRNA)是一种内源性非编码小RNA,可在转录水平负调节靶基因的表达。越来越多的研究结果证明miRNA在肿瘤的转移过程中发挥着重要的作用。近几年来,miRNA与肿瘤转移关系的研究已成为探讨肿瘤转移调控机制的热点。研究miRNA对恶性肿瘤转移的作用机制有助于我们寻找治疗恶性肿瘤转移的新方法。本文就与抗肿瘤转移相关的miRNA的研究进展作一综述。
- 吕志红李学农
- 关键词：微小RNA肿瘤
- 降落和重叠延伸PCR构建靶向肿瘤干细胞腺病毒载体及感染实验被引量：1
- 2011年
- 目的应用降落和重叠延伸PCR法构建对肿瘤干细胞有特异靶向性的高效载体-复制缺陷型腺病毒载体,观察其对CD133+人大肠癌细胞株SW480的感染效率。方法利用重叠延伸PCR技术扩增5型腺病毒纤毛球端HI环两端的基因序列,定向插入真核表达质粒pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1.KNOB△HI,同时在缺失HI环部位引入EcoRV限制性酶切位点。在此基础上,用降落PCR克隆纤毛基因全长编码区序列,构建出腺病毒穿梭质粒pNEB-F5。利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性。再与pAdEasy-1,pShuttle-GFP在E.coli BJ5183中同源重组,得腺病毒载体Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP。用Ad5FHI-GFP和Ad5-GFP分别感染CD133+人大肠癌细胞株SW480,通过荧光显微镜观察感染效率。结果降落PCR和重叠延伸PCR都扩增出特异性条带,测序结果与预期相符。与Ad5-GFP相比,Ad5FHI-GFP对CD133+人大肠癌细胞株SW480有显著提高。结论利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,利用降落和重叠延伸PCR成功构建新型靶向肿瘤干细胞的腺病毒载体,其对CD133+人大肠癌细胞株SW480实验显示Ad5FHI-GFP组感染效率明显强于Ad5-GFP组。
- 张超刘国炳田平阁周春平李学农
- 关键词：降落PCR重叠延伸PCR复制缺陷型腺病毒穿梭质粒
- Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3'UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3'UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。
- 杨慧张超陆滟霞吴小金袁理周畅周春平刘国炳李学农
- 关键词：慢病毒结直肠癌细胞
