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基因工程重组乙型肝炎表面抗原与乙型肝炎Dane颗粒在乙型肝炎表面抗体检测中的联合应用被引量：2: 2005年; 目的用DNA重组技术在毕赤酵母中表达多聚组氨酸融合重组乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白,与血源乙型肝炎Dane颗粒联合使用,制备乙型肝炎表面抗体酶免试剂盒。方法将S基因插入酵母表达载体,转化毕赤酵母菌后表达重组抗原。表达产物包被聚丙乙烯反应板,与辣根过氧化物酶标记Dane颗粒配对,用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HBsAb。结果用重组HBsAg和Dane颗粒酶标记物制备的试剂对卫生部临床检验中心HBsAb质控物及血清标本进行检测,灵敏度达10mIu/ml,特异性达100%,重复性及线性良好,与进口商品试剂检测结果一致。结论毕赤酵母表达系统表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组HBsAg,可与酶标记血源Dane颗粒配对制备HBsAb免疫检测试剂,Dane颗粒的其他抗原成分不会干扰检测的特异性。; 梁敏坚洪国强胡波许珏李林; 关键词：HB 乙型肝炎表面抗体血源

乙型肝炎病毒S基因在毕赤酵母中的表达及在乙型肝炎病毒表面抗体检测中的应用被引量：5: 2004年; 目的　构建含有乙型肝炎病毒S基因的表达载体 ,在毕赤酵母中表达出高免疫反应性的重组乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)S蛋白 ,用以制备乙型肝炎表面抗体 (HBsAb)酶免试剂盒。方法采用聚合酶链反应从含乙型肝炎病毒全基因序列 (adw)的质粒PHBV1中扩增出S基因 ,并将其插入pPICZB质粒。携带有S片段的pPICZB质粒转化毕赤酵母菌株KM71H ,甲醇诱导重组酵母细胞表达S蛋白。表达产物包被聚丙乙烯反应板 ,用酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测HBsAb。结果　酶切电泳及DNA测序证实乙型肝炎病毒S基因已正确克隆到表达载体中 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示HBsAg在毕赤酵母中表达 ;表达量约占总蛋白的 2 5 %～ 35 %。表达产物用ELISA测定效价达 1∶2 5 6 0 0 ;Westernblot显示与正常人血清无交叉反应 ;用纯化产物作为包被抗原对卫生部临床检验中心HBsAb质控物及血清标本进行检测 ,灵敏度达 10mIu/ml,特异性达 10 0 % ,重复性及线性良好 ,与国产商品试剂检测结果一致。结论　毕赤酵母表达系统高效表达出具有良好免疫反应性和特异性的HBsAg。; 洪国强吴宗华胡波朱振宇李林; 关键词：乙型肝炎病毒S基因毕赤酵母乙型肝炎病毒表面抗体

乙型肝炎病毒核心基因在毕赤酵母中的表达及表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体检测中的应用评价被引量：13: 2005年; 目的在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg),探讨该表达产物在乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)免疫检测中的应用。方法用PCR从含有乙型肝炎病毒DNA模板的质粒中扩增出编码HBcAg的C基因,插入pPIC9酵母表达载体。携带有C片段的pPIC9转化毕赤酵母菌株GS115,经甲醇诱导表达HBcAg。分别用分子筛纯化毕赤酵母表达的HBcAg(A)、单克隆HBcAb特异结合纯化毕赤表达的HBcAg(B)、分子筛纯化大肠杆菌表达的HBcAg(C)、单克隆HBcAb特异结合纯化大肠杆菌表达的HBcAg(D)作为固相抗原,辣根过氧化物酶标记多克隆HBcAb为探测抗体,用竞争抑制法酶联免疫吸附测定(competitiveinhibitionELISA)检测HBcAb标准品及含有乙型肝炎病毒PCR阳性和阴性血清的临床标本。结果聚丙烯酰胺凝胶电泳、immunoblot、ELISA显示HBcAg在毕赤酵母中高效表达;分别用抗原A、B、C、D制备的试剂检测中国药品生物制品检定所HBcAb国家参考品:试剂A与B结果相同:阴性符合率(-/-)15/15,阳性符合率(+/+)15/15;最低检出量(稀释度):灵敏度参考品2#=1∶128,3#=1∶16,4#=1∶64。试剂C与D结果相同:阴性符合率(-/-)15/15;阳性符合率(+/+)14/15;最低检出量(稀释度):灵敏度参考品2#=1∶32;3#=1∶16;4#=1∶32;大肠杆菌抗原的灵敏度明显低于毕赤酵母抗原。对乙型肝炎病毒PCR阳性及阴性的临床标本进行检测,结果如下:PCR阳性组HBcAb阳性检出率:试剂A97.8%;试剂B98.1%;试剂C96.6%;试剂D91.4%;A、B、C三组间比较差异无统计学意义(P>0.05);D分别与A、B、C相比较差异均有统计学意义(P<0.005)。PCR阴性组HBcAb阴性检出率:试剂A80.3%;试剂B80.9%;试剂C75.0%;试剂D85.7%;AB两组比较差异无统计学意义(P>0.05);AC、AD、BC,BD、CD相比较差异均有统计学意义(P<0.005);分子筛纯化的大肠杆菌HBcAg含有干扰检测的杂质,结果出现假阳性;大肠杆菌HBcAg存在表位缺失导致结果�; 梁敏坚洪国强李朝霞胡波许珏李林; 关键词：乙型肝炎病毒核心基因乙型肝炎病毒核心抗原 HBCAB 毕赤酵母表达系统阳性符合率

乙型肝炎病毒合成e基因在毕赤酵母中的表达及产物免疫学特性被引量：7: 2006年; 目的合成适合酵母表达的乙型肝炎病毒(HBV)e 抗原基因,在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒 e 抗原(HBeAg)。方法采取基因搭桥法及 Taq 酶聚合反应,选用酵母菌偏爱的同义密码子替换野生型 e 基因的部分密码子,制备合成 e 基因,插入 pPICZαA酵母菌表达载体。携带有合成 e 基因的 pPICZαA转化毕赤酵母菌株 GS115,经甲醇诱导表达 HBeAg。结果酶切电泳及 DNA 测序证实合成的 e 基因已正确克隆到表达载体中;聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、immunoblt 及 ELISA 显示 HBeAg 在毕赤酵母中高效分泌表达,表达量约为63mg/L,培养上清液 ELISA 测定效价1:81920,最大吸光度值达2.8;重组 HBeAg 与乙型肝炎病毒核心抗体间无交叉反应。结论毕赤酵母表达系统高效分泌表达出与乙型肝炎病毒核心抗原间无交叉抗原性、具有良好免疫反应性的 HBeAg。; 李朝霞席云洪国强胡波梁敏坚许珏李林; 关键词：基因表达毕赤酵母酶联免疫吸附测定

乙型肝炎病毒C基因在毕赤酵母中的表达被引量：3: 2004年; 目的研究乙肝病毒核心(C)基因在毕赤(Pichiapastoris)酵母中的表达,以期获得高效表达的具有良好免疫反应性和特异性的重组乙肝病毒核心蛋白(HBcAg)。方法采用PCR法从含HBV全基因序列的质粒pHBV1中扩增C基因,亚克隆到pGEM-T载体中,经DNA序列分析后将目的基因定向克隆到酵母表达载体pPIC9中,构建重组质粒pPIC9-cAg。然后用电转法将重组质粒转化入酵母菌GS115,05%甲醇诱导表达。采用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA法对表达产物进行分析。结果限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBVC基因已正确克隆到酵母表达载体pPIC9中;SDS-PAGE结果显示重组HBcAg在毕赤酵母细胞中表达;ELISA及Westernblot分析表明,表达产物具有良好的免疫反应性和特异性,重组HBcAg的滴度可达1∶12800。结论成功构建了pPIC9-cAg重组质粒,并在毕赤酵母中高效表达了具有良好免疫反应性和特异性的重组HBcAg,为进一步研制抗-HBc诊断试剂盒奠定了基础。; 李朝霞梁敏坚李林胡波朱振宇; 关键词：免疫反应性基因表达毕赤酵母

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广东省自然科学基金(021858)

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