广东省自然科学基金(021857)
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
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- 相关机构：中山大学附属第三医院广东医学院附属福田医院更多>>
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- CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达
- 2005年
- 【目的】构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达。【方法】分离人外周血单个核细胞，提取细胞总RIgA，经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区（含绞链区-CH2-CH3）基因片段。将PCR产物克隆入pCDNA3，阳性重组子以双酶切和测序鉴定。将目的基因CTLA4-Ig亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183，经细菌内同源重组构建重组腺病毒载体。采用脂质体法转染293细胞包装产生重组腺病毒，进一步感染HepG2细胞，采用RT-PCR及ELISA测定CTLA4Ig表达情况。【结果】构建了表达人CTLA4Ig基因的重组腺病毒，病毒滴度可达6×10^9pfu／mL，并能在HepG2和骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig。【结论】成功构建表达CTLA4Ig的重组腺病毒载体，为进一步研究肝细胞移植排异及自身免疫性疾病的免疫调节治疗提供有力的手段与工具。
- 马会慧陆才生陈雪娟高志良李刚杨绍基姚集鲁
- 关键词：腺病毒基因表达
- SV40LTag基因诱导永生化大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定被引量：3
- 2007年
- 目的:建立长期传代、形态和生物学特性稳定的永生化HSC。方法:采用Pronase E、Ⅳ型胶原酶原位灌流消化及Nycodenz密度梯度离心分离大鼠原代肝星状细胞(HSC),并进行免疫组化SABC法鉴定和培养。用Effectene Transfection Reagent方法将携带SV40LTag基因的质粒PSV3neo(该质粒由意大利学者Giovanni Gaud-ino PhD惠赠)转染第1代HSC,以G418筛选直至获得阳性克隆细胞,经体外长期培养和传代后,以PCR方法检测其SV40LT抗原mRNA的表达,观察细胞形态学,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖能力,用免疫组化SABC法对α-SMA、SV40LTag、Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagenⅠ、collagenⅢ)、desmin、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生的生长因子受体β型(PDGFRβ)进行免疫细胞化学检测,用β-actin做半定量RT-PCR检测I型胶原的表达,对其生物学特性进行研究。结果:本研究通过使用质粒PSV3neo转染正常大鼠HSC,经20 d抗性筛选,获得G418阳性克隆细胞,长期传代后细胞形态和结构保持完好,SV40LTag mRNA的表达检测和免疫组化染色结果阳性,经扩大筛选培养,该HSC细胞系目前已传了50代,保持着星形外观的HSC形态学特征,生长曲线显示转染阳性细胞倍增速度快,MTT法测定570 nm波长下A值显著高于对照组(P<0.01)。半定量RT-PCR法检测collagenⅠmRNA的表达明显高于对照组(P<0.01)。免疫组化染色显示能表达α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ、desmin、TGF-β1、PDGFRβ。结论:利用SV40LTag基因序列诱导建立了永生化大鼠HSC系,新建HSC系在体外可长期传代,倍增速度快,其形态和生物学特性与原代HSC形态相似。
- 庄鹏马会慧江元森陈伟杨林姚集鲁
- 关键词：肝星状细胞细胞培养永生化
- 长期培养的大鼠原代肝细胞功能和形态学观察被引量：4
- 2005年
- 目的研究大鼠原代肝细胞长期体外培养后功能和形态的变化。方法采用两步胶原酶原位灌流法分离大鼠肝细胞,并用Percoll分离液进行密度梯度离心进一步纯化肝细胞,采用0.4%台盼蓝染色观察细胞活力。然后将细胞接种于HepatoZYME-SFM培养基中培养,定期收集肝细胞培养液上清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白、尿素氮的水平。采用乙氧基试卤灵O-脱乙基酶活性(EROD)方法检测肝细胞P450的CYPⅠA1功能。结果新鲜分离的大鼠肝细胞总数(2-3)×108cells/wholeliver,Percoll分离液纯化后活力和纯度在90%以上。HepatoZYME-SFM培养下肝细胞生长良好并保持正常形态。AST、ALT水平在培养3d后下降显著,6-9d后趋于相对稳定的低水平。白蛋白的分泌功能、尿素合成能力在18d内维持在较高水平。可在3-6d检测到CYPⅠA1酶活性。结论Percoll液纯化新分离肝细胞可提高其活率和纯度,HepatoZYME-SFM培养条件下肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力,适合肝细胞的体外长期培养和功能研究。
- 庄鹏江元森马会慧李志刚麦丽杨林姚集鲁
- 关键词：肝细胞细胞培养
