国家自然科学基金(30500560)
- 作品数：8 被引量：14H指数：2
- 相关作者：李昂苟建重石建峰饶国洲朱春晖更多>>
- 相关机构：西安交通大学西安交通大学口腔医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金陕西省自然科学基金西安市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 牙龈卟啉单胞菌肽酰精氨酸脱亚氨酶的克隆与表达被引量：1
- 2011年
- 目的:构建牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)克隆表达重组子,转化于大肠杆菌BL21中,并在最适宜条件下诱导表达。方法:以牙龈卟啉单胞菌ATCC33277全基因组DNA为模板,利用PCR技术获得目的基因PAD,将扩增得到的PAD基因定向插入线性克隆载体PMD18-T Vector中,得到克隆重组子PMD18-T-PAD。经PCR和双酶切鉴定正确的克隆重组子PMD18-T-PAD与表达载体PET-28a经Xhol和Ncol双酶切后,在一定连接体系下,连接构建表达质粒PET-28a-PAD。鉴定正确的原核重组表达质粒PET-28a-PAD,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,在不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及时间诱导下表达融合蛋白。以抗His Tag单克隆抗体为一抗,Western免疫印迹鉴定。结果:DNA测序结果表明,PAD与NCBI核酸数据库中收录的PAD序列同源性达100%;37℃,IPTG浓度为0.5mmol/L,250r/min振摇培养6h的诱导条件下,PAD可高效表达。结论:本实验成功构建了PAD的克隆表达重组子,并在大肠杆菌中表达了PAD蛋白,为进一步研究PAD的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。
- 李昂朱春晖石建峰魏虹刘瑾苟建重
- 关键词：牙龈卟啉单胞菌原核表达
- 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选牙龈卟啉单胞菌共同外膜蛋白被引量：4
- 2010年
- 目的 应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技术筛选多种牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）共同外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）,为针对多种Pg设计具有交叉保护作用的疫苗提供候选靶抗原.方法 应用超速离心法提取PgATCC33277、Pgw83、Pg301和Pg381菌株外膜蛋白,SELDI疏水性蛋白芯片H50检测OMP,Biomarker Wizard软件分析4种菌株OMP质谱图.结果 OMP质谱图显示,PgATCC33277、PgW83、Pg301和Pg381分别有71、74、76和72个蛋白质峰,并存在13种共同OMP 在美国国立生物信息中心蛋白库中鉴定到一种已知蛋白gil116636495,其功能尚不清楚.结论 发现13种共同OMP可作为牙周病疫苗候选抗原,证实基于SELDI-TOF-MS技术适合检测小相对分子质量（＜20000）、低丰度、疏水性蛋白,且操作简单、重复性好,可用于大规模寻找Pg的共同OMP.
- 李昂孙俊毅孙媛媛石建峰饶国洲苟建重
- 关键词：细菌外膜蛋白质类表面增强激光解吸电离飞行时间质谱
- “鸟枪”蛋白组学技术鉴定牙龈卟啉单胞菌47A-1亚型外膜蛋白被引量：1
- 2011年
- 目的利用shotgun（鸟枪）蛋白质组学策略鉴定牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.g）亚型47A-1外膜蛋白,深化P.g外膜蛋白的蛋白质组学研究,为进一步研究P.g外膜蛋白的致病性奠定基础。方法提取P.g47A-1外膜蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白,胶内酶解为多肽混合物,应用毛细管高效液相色谱加串联质谱分析,SEQUEST程序进行数据库搜索并鉴定蛋白。结果用考马斯亮蓝法染色凝胶分离的蛋白,发现P.g47A-1蛋白条带主要在14.3~97 ku之间。酶解的肽段经毛细管高效液相色谱分离,得到肽段水平的总离子流图,分析肽段序列后发现P.g47A-1蛋白有623个唯一肽段,鉴定出136种蛋白,包括了51种已知蛋白,85种未知蛋白。结论 Shotgun技术可分析出P.g47A-1大量未知蛋白,尤其是丰度低、疏水性强的外膜蛋白,优于二维凝胶电泳（two dimensional gelelectrophoresis,2-DE）等传统蛋白质组学方法,为进一步研究P.g外膜蛋白的致病性奠定了基础。
- 孙俊毅孙媛媛苟建重李昂
- 关键词：牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白鸟枪法蛋白质组学
- 牙周炎疫苗候选抗原筛选的研究现状
- 2007年
- 孙媛媛李昂苟建重
- 关键词：疫苗候选抗原牙周炎牙龈卟啉单胞菌细菌感染性疾病牙周致病菌新型疫苗
- 牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达被引量：1
- 2011年
- 目的克隆牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),并将其置于大肠杆菌中作融合表达。方法利用PCR技术,克隆GAPDH,插入克隆载体pMD18-T中得到克隆重组子pMD18-T-GAPDH。克隆重组子与表达载体pET-32a双酶切后连接构建表达质粒pET-32a-GAPDH。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以不同浓度异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果核酸序列测定与分析表明:表达重组子pET-32a-GAPDH与NCBI核酸数据库中收录的GAPDH序列同源性达99.802%;在最佳浓度的IPTG诱导下,GAPDH可高效表达。结论本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中表达了GAPDH蛋白,为后续实验研究GAPDH的免疫学性能及相应的抗体制备奠定了基础。
- 李昂徐红艳石建峰朱春晖饶国洲苟建重
- 关键词：牙龈卟啉单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶原核表达
- 牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化被引量：6
- 2010年
- 目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,以抗6×HisTag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。
- 李昂谢红帼梁平朱春晖石建峰饶国洲苟建重
- 关键词：牙龈卟啉单胞菌
- 联合应用二维液相色谱及串联质谱技术筛选牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白抗原的初步研究被引量：1
- 2010年
- 目的 联合应用二维液相色谱（two-dimensional liquid phase fractionation,PF2D）及基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF-MS）技术,筛选多种牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）共同外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）,为针对多种Pg设计具有交叉保护作用的疫苗提供候选靶抗原.方法 超高速离心法提取Pg301、PgATCC33277和PgW83菌株OMP,应用PF2D目标蛋白快速分离系统分离OMP,对比分析得到共同OMP,用MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱结合数据库搜索,确定蛋白质一级结构.结果 第一维色谱聚焦分离,3株Pg共获得99个蛋白质样本;选定OMP组分B7,进行第二维反相色谱分离,3株Pg共确定了8个共同的蛋白色谱峰,运用MALDI-TOF/TOF-MS对蛋白样品进行鉴定,结果 确定了其中一个为已知的蛋白精氨酸-牙龈素A.结论 PF2D分离系统分辨率高、重现性好,结合MALDI-TOF/TOF-MS串联质谱技术,可用于鉴定Pg的共同OMP.
- 李昂司薇杭王嗣岑石建峰饶国洲苟建重司薇杭王嗣岑石建峰饶国洲苟建重
- 关键词：细菌外膜蛋白质类
- Shotgun法鉴定牙龈卟啉单胞菌Pg301外膜蛋白被引量：1
- 2013年
- 目的采用Shotgun法对牙龈卟啉单胞菌Pg301外膜蛋白进行分析,为筛选牙周炎疫苗候选抗原奠定基础。方法培养Pg301,提取外膜蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,胶内酶解成多肽混合物,经高效液相色谱-串联质谱分析,结合美国国立生物技术信息中心蛋白质数据库进行蛋白鉴定,获得外膜蛋白成分。结果分析出586个唯一肽段,鉴定出93种蛋白,其中有50种是已确定的蛋白。结论 Shotgun法能够快速高效分析细菌外膜蛋白,为筛选保护性抗原、毒力相关候选蛋白等奠定基础。
- 孙媛媛刘树泰刘丽梅李昂苟建重
- 关键词：牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白蛋白质组学
