国家自然科学基金(39970708)
- 作品数：4 被引量：18H指数：2
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- 一种重组腺病毒载体产生及操作的新方法被引量：12
- 2003年
- 目的 建立一种快速、高效的产生腺病毒的实验方法。方法 将增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)装在穿梭质粒 ,线性化后与腺病毒骨架载体一起电穿孔转染大肠杆菌 ,使之同源重组 ,产生病毒基因组质粒。后Pac酶切 ,脂质体介导转入 2 93细胞以包装出病毒。扩增后收获病毒 ,氯化铯密度梯度离心纯化 ,空斑试验测滴度。结果 5 2个大肠杆菌克隆 ,其中有 1个发生同源重组 ,产生腺病毒基因组质粒pAdEGFP ,转染 2 93细胞 ,荧光显微镜下产生绿色荧光。病毒纯化后达 10 11pfu/ml。 结论 大肠杆菌内质粒间同源重组的方法可以高效、简便、快捷地产生重组腺病毒载体 。
- 胡中波仲照东张友山彭程卢运萍邹萍
- 关键词：绿色荧光蛋白同源重组腺病毒载体大肠杆菌
- 一种小鼠可溶性Fas cDNA的克隆与表达被引量：4
- 2002年
- 为获得调节鼠Fas Fas配体系统诱导凋亡的作用 ,根据GenBank中小鼠Fas基因碱基序列 ,设计扩增可溶性Fas(solubleFas ,sFas)引物 ,用RT PCR方法从幼鼠胸腺组织中克隆出与人可溶性Fas类似的新的鼠sFas (FasC)cDNA序列 .该序列缺乏Fas基因的跨膜区片段 ,但不改变其阅读框 .采用定向克隆的方法将之插入pUC19中间载体 ,DNA序列测定证实该片段序列与预期序列完全一致 .利用亚克隆的方法将鼠FasC的cDNA片段克隆到真核表达载体pCA13上 ,构建出重组载体pCA13 FasC ,通过脂质体LF2 0 0 0转染至 2 93细胞 .RT PCR和Western印迹证实 ,鼠FasC在 2 93细胞获得高效表达 .凋亡诱导实验表明 ,鼠FasC的表达可阻断Fas诱导凋亡的作用 ,证实了所转染鼠FasC的生物活性 .
- 胡中波邹萍李爱香肖娟仲照东刘凌波
- 关键词：小鼠可溶性FASCDNA真核表达肿瘤细胞免疫细胞
- 转染sFas基因骨髓移植阻抑白血病小鼠肿瘤细胞的免疫逃逸被引量：1
- 2006年
- 目的探讨骨髓细胞转染小鼠可溶性Fas（sFas）基因后移植能否阻抑白血病小鼠肿瘤细胞的免疫逃逸。方法用AdEasy系统构建携带sFas和EGFP的腺病毒质粒，先按病毒／细胞的感染倍数（MOI）为100的比例分别直接感染呈对数生长期的EL4细胞，培养24h后，采用氚标记胸腺嘧啶掺入法检测其诱导YAC-1细胞凋亡的情况。然后同法以携带sFas和EGFP的腺病毒质粒分别转染雄性C57BL／6小鼠骨髓细胞，每只雌性C57BL／6小鼠（白血病模型）通过尾静脉接受5×10^6～10×10^6个转染sFas或EGFP的雄性C57BL／6小鼠骨髓单个核细胞移植。移植后观察受者的造血重建情况、白血病／淋巴瘤的发生及生存率。结果体外实验中，转染EGFP的EL4细胞诱导YAC-1细胞凋亡的情况与非转染的EL4细胞相似，转染sFas基因后，YAC-1细胞的凋亡率明显下降（P〈0．01）。接受转染sFas基因的骨髓移植者，移植后8周受者全部存活（16／16），骨髓中未发现EL4细胞，造血功能恢复良好，能检测到Y染色体；接受转染EGFP的骨髓移植者，移植后8周仅1只小鼠（1／16）存活（P〈0．01），在死亡和存活的小鼠中均存在EL4细胞，其造血重建情况较转sFas者差。结论转染sFas基因的造血细胞移植可以在体内阻抑肿瘤细胞的免疫逃逸，同时不影响造血重建功能。
- 黎纬明赵智刚邹萍胡中波李爱香刘凌波
- 关键词：转染肿瘤逃逸骨髓移植白血病
- 阻抑骨髓移植受者白血病细胞免疫逃逸的实验研究被引量：1
- 2003年
- 目的 了解转染小鼠可溶性Fas(sFas)基因后的骨髓移植 (BMT)能否阻抑白血病细胞的免疫逃逸 ,从而消灭残留白血病细胞、减少白血病复发。方法 经尾静脉向雌性C57BL 6小鼠体内植入EL4细胞 1 0 5个 只 ,建立移植性小鼠T细胞白血病 淋巴瘤模型。用转染sFas基因的腺病毒 (Ads Fas)感染 2 4h的雄性C57BL 6小鼠 (H 2 b)骨髓单个核细胞 ,对60 Co致死量照射的雌性同系小鼠进行BMT(D组 ) ,同时设立 :空白对照组 (A组 ,无骨髓细胞植入 )、常规BMT组 (B组 ,骨髓细胞未感染病毒 )、白血病组 (C组 ,仅输入EL4细胞 ,不进行照射和BMT)和绿色荧光蛋白 (EGFP)移植组 (E组 ,骨髓细胞感染AdEGFP)。观察各组造血重建情况、白血病 淋巴瘤的发生及小鼠生存率。结果 BMT后 1 0天脾指数检查 ,B、D、E三组之间差异无显著性 (P >0 .0 5) ,各组与A组间差异有显著性 (P <0 .0 1 )。移植后 30天外周血检查 ,B和D组恢复正常 ,C和E组白细胞和血小板均低下。 2个月后嵌合体检查存在Y染色体 ,骨髓细胞学检查B、D两组基本正常 ,C、E两组存在大量的瘤细胞。C组与E组死亡小鼠组织病理学显示脾脏等部位存在瘤细胞 ,而存活的B和D组小鼠基本正常。生存率 :A组全部死亡 ,B组 (6只 )和D组 (1 6只 )全部存活 ,C组存活 2只 (1 2 .5 % ) 。
- 胡中波张友山李爱香刘凌波邹萍
- 关键词：骨髓移植白血病免疫逃逸FAS基因
