国家自然科学基金(39870175)
- 作品数：3 被引量：15H指数：3
- 相关作者：刘景晶吴洁谢燕飞胡卓逸明欣更多>>
- 相关机构：中国药科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人甲状旁腺素N端34肽基因的合成、克隆及融合表达被引量：5
- 1999年
- 选用大肠杆菌偏爱的密码子,用计算机辅助设计、合成长度分别为59 、59 及60 碱基的三段寡核苷酸。以中段寡核苷酸为模板,两端寡核苷酸为引物,经PCR 合成完整的hPTH(134) 基因,并克隆到pUC18 载体中。对克隆基因进行序列分析,结果与设计的完全一致。将该基因与表达载体pKA 连接构建表达质粒pKAT,转化大肠杆菌JM105 细胞,SDSPAGE 表明hPTH(134) 融合蛋白获得了表达,并且酸水解后融合蛋白被裂解为大小两个片段。
- 王朝晖刘景晶丁敏
- 关键词：聚合酶链式反应基因克隆
- 重组人源胰岛素原C肽在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化(英文)被引量：5
- 2006年
- 目的:构建一种新型表达载体(pEDCC),表达并纯化得到人源胰岛素原C肽。方法:将编码截短的门冬酰胺酶突变体(ansB-C),天然C肽,人IgG1铰链区(hinge),额外的酸敏感二肽(DP)以及富含碱性氨基酸的8肽(KRKRKKSR)的核苷酸序列依次分别插入pET28a载体中,构建表达载体pEDCC。在乳糖的诱导下,融合蛋白ansB-C-hinge-DPKRKRKKSRNGS-GR-C-peptide以包涵体形式高效表达。融合蛋白经洗涤和乙醇分级沉淀纯化后,通过酸水解将PKRKRKKSRNGSGR-C-peptide释放出来。C肽N端14肽用胰蛋白酶切割,通过DE52柱与C-peptide分离。结果:构建的表达载体pEDCC序列正确,融合蛋白经分离纯化得到了高纯度的重组人源胰岛素原C肽。结论:以截短的门冬酰胺酶作为融合伙伴,并以富含碱性氨基酸的8肽调节等电点是一种生产重组人源胰岛素原C肽的有效方法。
- 王学军顾凯曹荣月林洁吴洁刘景晶
- 关键词：基因融合门冬酰胺酶胰蛋白酶
- 重组乳酸乳球菌X-脯氨酰二-肽酰基-氨基肽酶的纯化及动力学特性(英文)被引量：5
- 2003年
- 重组的乳酸乳球菌X 脯氨酰 二肽酰基 氨基肽酶是一个工具酶 ,它对基因构建的神经肽或活性多肽的转活具有重要意义 .通过细菌细胞的破碎 ,洗涤 ,冷冻离心 ,透析 ,DEAE 纤维素 5 2柱层析等工艺过程达到电泳纯 .该酶比活为 11.92 6U mg ,纯化倍数为 14.37倍和总活性收率为5 5 .5 6% .通过SDS PAGE和凝胶柱层析法 ,测得该二肽酶有单肽链组成 ,分子量 89KD .在该酶的动力学研究中 ,针对特异性底物L 甘氨酰 L 脯氨酰 对 硝基苯胺 ,求得该酶的米氏方程式 1 V =0 0 4 8 [S]+ 0 2 5 66(r =0 994 ) .它的Km 值为 0 1871mmol L ,最大反应速度Vmax为 3 897μmol·L-1·min-1.该酶可被苯甲酰基磺酰氟 ,胰蛋白酶抑制剂和Mn2 +,Ba2 +,Cu2 +andZn2 +等金属离子抑制 ,但可被Mg2 +激活 .进一步试验显示 ,当Cu2 +和Zn2 +浓度增加到 3 72 6mmol L ,抑制作用明显增强 .低浓度的EDTA Na2 (≤ 0 62 12mmol L)不影响酶的活性 .因此 ,该X 脯氨酰 二肽酰基
- 唐松山吴洁谢燕飞明欣胡卓逸刘景晶
- 关键词：丝氨酸蛋白酶动力学特性纯化
