国家教育部博士点基金(20060392003)
- 作品数：6 被引量：24H指数：4
- 相关作者：林建华王长昇吴朝阳陈少强贾小力更多>>
- 相关机构：福建医科大学福建卫生职业技术学院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 重组腺病毒Ad5hBDNFEGFP的构建及体外转染大鼠间充质干细胞后基因表达被引量：2
- 2011年
- 目的：构建以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为标志基因、人脑源性神经营养因子（hBDNF）基因为目的基因的重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP，体外转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs），探讨转染效率及转染基因的表达情况。方法：构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP；利用AdMax包装系统，穿梭质粒与骨架质粒共转染293细胞，同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP，经反复感染293细胞扩增病毒。SD大鼠骨髓，体外分离、培养rMSCs，流式细胞仪检测rMSCs表面标记物；不同感染复数（MOI）的重组腺病毒转染第3代rMSCs，检测转染率及hBDNF蛋白的表达变化。结果：PCR、酶切鉴定及测序证实穿梭质粒和重组腺病毒载体成功构建。rMSCs流式细胞仪检测CD34、 CD45阴性表达，CD29、 CD90阳性表达。腺病毒体外转染rMSCs后荧光显微镜下可见绿色荧光信号表达，免疫印迹法检测出hBDNF蛋白的表达；绿色荧光表达强度、转染率及hBDNF蛋白的表达水平均随着腺病毒MOI的增加而增加，最佳MOI为100。结论：体外成功构建Ad5-hBDNF-EGFP，并能有效转染rMSCs，成功获取基因工程干细胞，hBDNF及EGFP基因均可在该细胞中得到有效表达。
- 王长昇林建华吴朝阳张立群
- 关键词：人脑源性神经营养因子增强型绿色荧光蛋白
- 大鼠脊髓损伤后炎症反应对静脉移植骨髓基质干细胞存活和迁移的影响被引量：4
- 2009年
- 目的通过观察大鼠脊髓损伤（SCI）后炎症反应对静脉移植骨髓基质干细胞（BMSCs）存活和迁移的影响，探讨BMSCs移植的最佳时间。方法40只SD大鼠随机分为假手术组、SCI后0h．6h、12h、24h、3d、5d和7d组，每组5只，不同时间点取脊髓组织，行HE染色和髓过氧化物酶（MPO）活性测定；另40只sD大鼠随机分为假手术组、SCI后0h、6h、12h、24h、3d、5d和7d移植组，每组5只，移植后7d取脊髓组织，荧光显微镜下观察不同移植时间点SCI处BMSCs的存活和迁移情况。结果SCI后6h，中性粒细胞开始浸润，MPO活性开始表达；SCI后24h，中性粒细胞大量浸润，MPO活性表达达到峰值；SCI后3d。中性粒细胞浸润减少，MPO活性表达开始减弱；SCI后7d，SCI区有胶质细胞增生和空洞形成。SCI后0h、6h、12h、24h移植组，SCI处BMSCs的存活数量较少，但迁移距离较长；SCI后3d移植组，SCI处BMSCs的存活数量较多，且迁移距离较长；SCI后5d和7d移植组，SCI处BMSCs的存活数量较少，且迁移距离较短。结论SCI后3d是静脉移植BMSCs治疗大鼠SCI的最佳时间。
- 陈少强林建华
- 关键词：脊髓损伤细胞存活细胞运动
- 骨髓基质干细胞旁分泌作用促进大鼠损伤脊髓的血管新生被引量：4
- 2015年
- 目的 观察移植骨髓基质干细胞（BMSCs）旁分泌作用对大鼠损伤脊髓血管新生的促进作用. 方法 用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离、纯化、培养大鼠BMSCs,应用流式细胞技术检测BMSCs表面细胞标志CD34、CD45、CD29、CD90;根据改良Allen法制备大鼠脊髓损伤模型,54只清洁型SD大鼠分为假手术组、对照组和实验组（n=1 8）,假手术组和实验组经尾静脉注射BMSCs,对照组经尾静脉注射PBS.移植BMSCs后l、7、14d应用免疫荧光标记观察羧基荧光素乙酰乙酸标记的BMSCs表达血管内皮细胞生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的情况;应用免疫组化检测移植BMSCs对损伤脊髓第Ⅷ因子相关抗原表达的影响;应用逆转录-聚合酶链反应法检测移植BMSCs对损伤脊髓VEGF和bFGF mRNA表达的影响. 结果 激光共聚焦显微镜显示移植的BMSCs可在脊髓损伤处及损伤附近区域聚集、存活且表达VEGF和bFGF.实验组大鼠脊髓内第Ⅷ因子相关抗原的灰度值、微血管密度以及VEGF mRNA和bFGF mRNA的表达量明显高于对照组和假手术组,差异均有统计学意义（P＜0.05）;而且实验组14d微血管密度、VEGF mRNA、bFGF mRNA的表达量较1、7d明显升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）. 结论 BMSCs在损伤脊髓内可以通过旁分泌VEGF和bFGF增加微血管密度,促进损伤脊髓的结构和功能恢复.
- 陈少强吴碧莲贾小力林建华
- 关键词：骨髓间质干细胞碱性成纤维生长因子
- 静脉移植骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤后少突胶质细胞再髓鞘化的影响被引量：4
- 2009年
- 有研究结果表明，骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗SCI能明显改善脊髓的神经功能。我们应用常规电镜技术和免疫组织化学荧光标记方法，观察MSCs移植治疗对损伤脊髓少突胶质细胞超微结构和髓磷脂碱性蛋白（MBP）、髓鞘蛋白前脂蛋白（PLP）含量的影响，并探讨其机制。
- 陈少强林建华
- 关键词：骨髓间充质干细胞少突胶质细胞脊髓损伤髓鞘化静脉移植髓磷脂碱性蛋白
- 人脑源性神经营养因子基因修饰BMSCs经静脉移植对大鼠损伤脊髓结构和功能影响的初步研究被引量：8
- 2010年
- 目的探讨采用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green?uorescent protein,EGFP)为报告基因的人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)基因修饰的大鼠BMSCs经静脉移植后,在大鼠损伤脊髓内存活和基因表达情况,及对损伤脊髓的修复效果。方法健康成年雄性SD大鼠96只,体重(250±20)g。取第3代SD大鼠BMSCs,以感染复数为100转染重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP及Ad5-EGFP,制备密度为1×106个/mL的hBDNF-EGFP-BMSCs和空载体-EGFP-BMSCs单细胞悬液。随机分为4组,hBDNF-EGFP-BMSCs静脉移植组(A组)、空载体-EGFP-BMSCs静脉移植组(B组)、损伤对照组(C组)和假手术组(D组),每组24只。A、B、C组采用改良Allen重物打击法制作T10节段脊髓损伤模型;D组大鼠同法暴露T10节段脊髓,但不造成脊髓冲击损伤。模型建立3d后,A、B、C组分别经尾静脉注射hBDNF-EGFP-BMSCs单细胞悬液、空载体-EGFP-BMSCs及0.1mol/L PBS各1mL,D组不予注射。各组大鼠于脊髓损伤后24h及静脉移植后1、3、5周分别行大鼠后肢运动功能BBB评分、皮层体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potential,CSEP)检测、荧光倒置相差显微镜观察、Western blot法检测、免疫组织化学染色观察及透射电镜观察。结果静脉移植后,A组恢复最快,3、5周时BBB评分高于B、C组(P<0.05)。A、B、C组于静脉移植5周时可检测到CSEP,A组潜伏期缩短及峰峰值增加较B、C组明显(P<0.05)。各时间点A、B组大鼠脊髓损伤节段均可观察到绿色荧光,C、D组各时间点均未检测到绿色荧光。静脉移植后1、3、5周,A组均检测出hBDNF蛋白表达,其他各组均未检测出hBDNF蛋白表达。A、B、C组神经丝蛋白200(neurofi lament200,NF-200)及突触素Ⅰ表达均随着静脉移植时间延长逐渐增强,至5周时各组表达达高峰,其中A组表达最强(P<0.05);各时间点A、B、C组NF-200表达均强于D组,而各时间点A、B、C组突触素Ⅰ表达均弱于D组,差异有�
- 林建华王长昇吴朝阳
- 关键词：BMSCS人脑源性神经营养因子脊髓损伤基因修饰静脉移植
- 重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定被引量：4
- 2009年
- 背景:基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向,目的基因和载体是基因治疗的关键。目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)标志人脑源性神经营养因子(humanbrain-derived neurotrophic factor,hBDNF)基因重组腺病毒载体。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成。材料:感受态大肠杆菌DH-5α购自美国Stratagene公司;pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre、腺病毒包装系统AdMax和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobix-Biosystems公司。方法:以pDC316-hBDNF为模板,聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段,连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP。利用AdMax包装系统,穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度。主要观察指标:①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定。②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定。③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化。④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定。⑤纯化病毒的滴度测定结果。结果:经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP/mL,A260/A280值约为2.0,滴度为0.8×1010CCID50/mL。结论:已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础。
- 王长昇林建华吴朝阳
- 关键词：腺病毒载体增强型绿色荧光蛋白
