河北省科技攻关计划(06276455)
- 作品数：2 被引量：10H指数：2
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- 重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究被引量：9
- 2007年
- 目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶（rhCu,Zn-SOD）,并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25-70℃和pH 5.0-10.5内活性稳定,并可耐受2-10 mol·L^-1的尿素和2%-8%的十二烷基硫酸钠（SDS）,对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。
- 刘建荣赵晓瑜宋小青静天玉
- 关键词：包含体复性
- 国产和进口培养基发酵培养重组人SOD工程菌的比较研究被引量：2
- 2007年
- 目的以国产培养基替代昂贵进口培养基发酵培养重组人超氧化物歧化酶(rhSOD)工程菌。方法利用国产LB培养基对自行构建的含重组质粒pTK-rhSOD的基因工程菌E.coliDH5α通过摇瓶进行发酵培养,以SDS-PAGE分析方法考察不同菌体接种量(1%～5%)、菌体生长密度波长600nm处吸光度(A600)值、诱导时间(1～8h)、氨苄青霉素(Amp)浓度(终浓度150、200、250μg/ml)及加入时机(分别于接种前和诱导前加入)、摇瓶装液量(10%～40%)和诱导温度(42、43、44、45℃)对rhSOD表达的影响,优选最适培养条件,并与进口LB培养基进行比较。结果对于国产LB培养基,采用3%～5%接种量,菌体密度生长至A600达0.38～0.63,诱导前补加Amp由初始的100μg/ml至200μg/ml,于42～44℃诱导3～5h,rhSOD表达量可达30%;对于进口LB培养基,采用2%接种量,菌体密度生长至A600达0.55～0.93,诱导前补加Amp由初始的100μg/ml至150μg/ml,于42～43℃诱导2～4h,rhSOD表达量可达30%。两种培养基摇瓶装液量对rhSOD的表达均没有明显影响。结论国产LB培养基经条件优化后可获得与进口培养基相同的目的蛋白表达量,可以替代昂贵的进口产品,为rhSOD进一步规模化生产降低发酵成本提供了实验依据。
- 刘建荣赵晓瑜步得志顾雅君静天玉
- 关键词：超氧化物歧化酶重组蛋白质类培养基
