国家杰出青年科学基金(30228026)
- 作品数：10 被引量：127H指数：5
- 相关作者：黄爱龙张秉强唐霓闫歌向明确更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第二医院重庆医科大学重庆医科大学附属第一医院更多>>
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- 凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达
- 2004年
- 目的 :克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达。方法 :RT -PCR扩增Survivin编码序列 ,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒 ,转染哺乳动物细胞 ,利用GFP绿色荧光和WesternBlot检测Survivin蛋白的表达。结果 :RT -PCR扩增出 4 2 1bp的Survivin编码序列 ,构建融合重组质粒pEGFP -C1-Survivin ,利用GFP荧光和WesternBlot证实Sur vivin蛋白的表达。结论 :成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达。
- 闫歌蒲丹唐霓张秉强高小玲宋文鑫何通川黄爱龙
- 关键词：SURVIVIN绿色荧光蛋白真核细胞
- 1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达被引量：29
- 2003年
- 目的 构建1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)真核细胞表达载体,观察其在HepG2细胞中的表达。方法 从pGEM—HBV载体上将约4.1kb的1.3倍HBV全基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1的Hind Ⅲ位点,将构建的pHBV经Lipofectamine2000导入肝癌细胞系HepG2细胞中。分别在转染后24、48、72h测定HepG2上清液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的表达,细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫组织化学染色,Southern、northern杂交鉴定HBV的复制与表达。结果成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体,转染后24、48、72h细胞上清液中HBsAg分别为5.36±0.25,13.42±1.24,7.52±0.43;HBeAg分别为9.16±0.32,22.75±1.49,15.96±1.03。免疫荧光结果显示转染后24 h细胞内HBsAg表达最强,主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。Southern、northern杂交均证实细胞内存在各种病毒复制中间体和特异的病毒复制转录物。结论 该表达载体可介导高水平病毒复制,其转染细胞可望成为一种新型的HBV 体外感染模型。
- 唐霓黄爱龙张秉强闫歌向明确蒲丹郭晖
- 关键词：乙型肝炎病毒HEPG2细胞
- RNA干扰技术对肝癌细胞内源survivin基因表达的影响被引量：21
- 2004年
- 应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对凋亡抑制因子survivin的siRNA抑制肝癌细胞株内源survivin基因的表达.转染重组质粒pshRNA survivin至肝癌细胞株SMMC 772 1,通过免疫荧光、蛋白质印迹和半定量RT PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化.结果表明:构建的三种重组质粒pshRNA survivin1/2/3均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA survivin的实验组survivin荧光强度明显低于转染载体pTZU6 +1和pshRNA GFP对照组;蛋白质印迹结果表明,重组质粒pshRNA survivin明显抑制survivin蛋白的表达,抑制率为 6 2 %～ 78%,通过半定量RT PCR检测到survivin基因mRNA转录明显减少,抑制率为5 7%～ 6 4 %.由上述结果可以得出结论:重组质粒pshRNA survivin可明显抑制SMMC 772 1细胞内源survivin的表达和mRNA的转录。
- 闫歌蒲丹 唐霓高小玲宋文鑫卢年芳吴刚Tong-Chuan He 黄爱龙
- 关键词：RNA干扰肝癌细胞株SURVIVIN基因
- 短发夹状RNA抑制survivin基因在肝癌细胞中的表达被引量：20
- 2003年
- 目的 构建抗凋亡因子survivin的短发夹状RNA(shRNA),观察其在肝癌细胞株HepG2、SMMC—7721中对survivin基因表达的抑制作用。方法 设计、合成两对survivin编码基因的反向重复序列,中间分别间隔4和8个nt,分别定向克隆至载体pTZU6+1的U6转录启动子下,构建pshRNA—survivin 1和pshRNA—survivin 2重组质粒,与表达survivin基因的质粒pEGFP—C1-survivin共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC—7721,荧光显微镜下观察融合蛋白中GFP的表达以分析pshRNA—survivin对survivin基因表达的抑制作用。结果 酶切分析和测序证实pshRNA—survivin 1和pshRNA—survivin 2构建成功;两组shRNA对survivin的表达均有明显的抑制作用,抑制率达80％以上;两重组质粒在HepG2和SMMC—7721两种细胞中抑制目的基因的作用无明显差异;反向重复序列中间隔4或8个nt构建的shRNA,对抑制目的基因的表达无显著差异。结论 构建的pshRNA—survivin重组质粒能有效抑制survivin基因在肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721中的表达。
- 闫歌黄爱龙唐霓张秉强蒲丹向明确兰英华吴刚
- 关键词：短发夹状RNASURVIVIN基因肝癌癌细胞基因治疗
- 应用RNA干扰技术抑制乙型肝炎病毒抗原表达的实验研究被引量：60
- 2003年
- 目的 构建针对乙型肝炎病毒 (HBV)核心区的siRNA表达载体pSIHBV/C ,观察其对HBV复制和表达的影响。方法 将构建成功的 pSIHBV/C与 1 3倍HBV真核表达质粒pHBV1 3共转染HepG2细胞 ,转染后 2 4、4 8、72h ,用Abbott试剂检测细胞上清中HBsAg和HBeAg ,并用免疫荧光染色法观察细胞内病毒核心抗原和表面抗原的表达。结果 成功构建了针对HBV核心区的siRNA表达载体 pSIHBV/C ,并发现它能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌 ,转染后第 2天抑制率达高峰 ,分别为 92 %、85 % ,而随机序列的siRNA无此作用。免疫荧光染色结果也证实转染 2 4h后 ,随pSIHBV/C比例的升高 ,其对HBV抗原表达的抑制作用也随之增加 ,当pSIRNA/C与 pHBV1 3比例为 1∶2 0时 ,pSIHBV/C对细胞内HBsAg和HBcAg表达的抑制作用最强。 结论 乙型肝炎病毒核心区的siRNA具有显著和特异的抗HBV复制和表达的作用。
- 唐霓黄爱龙张秉强闫歌Tong-Chuan He
- 关键词：RNA干扰技术乙型肝炎病毒抗原慢性乙型肝炎
- shRNA抑制外源绿色荧光蛋白在肝癌细胞株中的表达被引量：3
- 2003年
- 目的 :构建绿色荧光蛋白 (GFP)的短发夹状RNA(shRNA) ,观察其在哺乳动物细胞中抑制外源GFP的表达。方法 :设计、合成含GFP编码基因片段 ,中间被 4个bp间隔的反向重复序列 ,与转录载体 pTZU6 +1连接 ,构建pshRNA—GFP重组质粒 ,与pEGFP -C1共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC - 772 1,检测其对GFP表达的影响。结果 :pshRNA—GFP对共转染的 pEGFP -C1中的绿色荧光蛋白有明显的抑制作用 ,抑制率达 70 %～ 85 %。结论 :构建的 pshRNA—GFP重组质粒能有效地抑制GFP在哺乳动物细胞中的表达。
- 闫歌黄爱龙唐霓张秉强向明确蒲丹
- 关键词：RNA干扰绿色荧光蛋白短发夹状RNA
- 向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用被引量：4
- 2005年
- 目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。
- 张秉强吴莹唐霓郭进军黄英汤华黄爱龙
- 关键词：SOUTHERN杂交乙肝病毒膜法琼脂糖凝胶电泳真核表达载体总DNA
- 应用干扰RNA体外抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒N基因的表达被引量：1
- 2005年
- 目的构建绿色荧光蛋白(GFP)与严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒N蛋白的融合表达载体pEGFP-C1-N以及针对SARS冠状病毒N基因的小发卡型shRNA表达载体pshRNAN,观察shRNA对SARS冠状病毒N基因复制和表达的影响。方法将构建成功的pEGFPC1N与pshRNAN共转染293细胞,于转染后24、48、72h观察GFP表达的强弱,采用Western Blot分别检测GFP与N蛋白的表达,逆转录PCR检测N基因的mRNA。结果psh-RNA-N作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组,Western Blot和逆转录PCR结果也证实pshRNA-N对N基因和N蛋白的表达有明显抑制作用,而无关序列的shRNA无此作用。结论针对SARS冠状病毒N基因的shRNA具有显著和特异的抑制N蛋白表达的作用。
- 陶鹏张君张秉强王超Tong-Chuan He 黄爱龙
- 关键词：SARS病毒SARS冠状病毒N基因体外抑制
- RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子表达被引量：7
- 2007年
- 目的:应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达。方法:将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2,通过RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光观察VEGF表达受抑的程度。结果:成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR发现其在HEK293和HT29细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率分别为72%和42%,但在Hela和HepG2细胞中的抑制率仅为28%和13%;Northern杂交显示,在HEK293细胞和HT29细胞中,VEGFmRNA明显受抑,抑制率达88%和89%;免疫荧光显示,在HT29细胞中,VEGF蛋白表达的受抑制率为73%。结论:针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达,但在不同细胞系中的作用强度存在差别。
- 李铁军康楷宋建宁胡瓒斓何通川张秉强张才全
- 关键词：RNA干扰血管内皮生长因子NORTHERN杂交
- 抑制Dicer基因对shRNA功能发挥的影响
- 2006年
- 本文将Dicer基因的RNA酶III结构域作为靶区,设计并构建了两个抗Dicer基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,将其转染2215、结肠癌TC细胞和基因组中整合有绿色荧光蛋白基因(GFP)的HepG2A9细胞,通过RT-PCR评价RNA干扰抑制Dicer基因表达的效率;当HepG2A9细胞Dicer基因表达被上述RNA干扰抑制时,再转染抗GFP的shRNA表达载体,通过RT-PCR和荧光显微镜观察GFP表达水平。结果显示,在不同细胞系中,这两个抗Dicer基因shRNA表达载体,均能明显抑制Dicer基因的表达;当Dicer基因受抑时,后续转染抗GFP的shRNA表达载体不能有效抑制GFP的表达。结果表明,抗Dicer基因shRNA表达载体,能够明显抑制Dicer基因的表达;shRNA表达载体的功能发挥需要Dicer酶的直接参与。
- 张秉强陈维贤黄英何茂锐吴莹张君Tong-Chuan He黄爱龙
- 关键词：RNA干扰DICER
