国家自然科学基金(81071934)
- 作品数：6 被引量：8H指数：2
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- 连接蛋白43偶合对多发性骨髓瘤细胞生物学行为的影响被引量：1
- 2021年
- 目的:观察由连接蛋白43(Cx43)组成的细胞间隙连接通讯(GJIC)及其介导的信号对多发性骨髓瘤(MM)细胞生物学行为的影响,并探讨其可能机制。方法:分离、培养MM患者、正常人骨髓间充质干细胞(MSC);采用RTPCR及蛋白印迹检测不同来源MSC中Cx43的表达,流式细胞术分选MM侧群细胞(SP),直接共培养后观察不同来源MSC对SP细胞周期、Cx43表达、体外集落形成、干细胞相关基因表达、细胞因子分泌和耐药的变化以及加入GJIC抑制剂18α甘草次酸(18α-GA)的影响。结果:MM患者及正常人骨髓所获的MSC形态及表型无明显区别,蛋白印迹证实,这两种MSC均表达较高水平的Cx43,与SP细胞共培养后可上调其Cx43表达,18α-GA可部分抑制该作用,对来源于MM患者的MSC作用更为显著(P<0.001);SP细胞具较强的体外集落形成能力,MM-MSCs具促进作用,加入18α-GA后SP细胞体外集落形成能力下降;RT-PCR检测证实RPMI 8266细胞存在少量c-myc、Klf-4、Sox-2和Oct-4基因表达,但SP细胞亚群中该类基因明显上调(P<0.001),MM-MSC可显著上调SP细胞c-myc、Klf-4和Sox-2基因的表达(P<0.001),而下调Oct-4基因表达,加入GJ阻断剂后,上调的基因均有不同程度下调,但无明显差异(P>0.05);CBA分析结果显示,MM-MSC分泌的高水平白介素(IL),与SP细胞共培养后,其上清中IL-6、IL-10及转化生长因子-β(TGF-β)表达上调(P<0.05),尤其是IL-6和IL-10较单独培养时显著上调(P<0.01),碱性成纤维细胞生长因子和IL-17共培养前后则无明显变化,加入18α-GA后,上清中IL-6、IL-10和TGF-β水平均明显降低(P<0.05);PI/Annexin V检测证实,MM细胞对硼替佐米诱导的凋亡敏感,但SP细胞敏感性较差,凋亡率分别为75.2%±0.77%和8.12%±0.86%(P<0.001),MM-MSC可显著减少硼替佐米介导的细胞凋亡(P<0.05),加入18α-GA可部分恢复MM细胞对硼替佐米的敏感性。结论:MM患者来源的MSC通过上调MM细胞Cx43表达,强化GJIC维持其"干"性,同时通�
- 孙谕张阳敏徐燕霞何苑宁张立莹傅晋翔
- 关键词：多发性骨髓瘤细胞间隙连接通讯连接蛋白43肿瘤微环境
- 骨髓间充质干细胞与多发性骨髓瘤细胞共培养后CX43表达及SDF-1α分泌水平的变化及其意义被引量：3
- 2013年
- 目的构建多发性骨髓瘤（MM）细胞与骨髓间充质干细胞（Msc）共培养体系，探讨共培养后MSC连接蛋白43（CX43）表达及基质细胞衍生因子（SDF）-1a分泌水平变化及其意义。方法用Westernblot、免疫荧光法检测MM细胞系及MM原代细胞CX43的表达及SDF-1a分泌水平。建立间接及直接共培养体系共培养MM细胞和MSC，然后用CD138磁珠法分离RPMI8226细胞及MSC。用实时定量PCR、Westernblot法检测共培养前后MSCCX43表达，免疫荧光法检测CX43分布；划痕实验检测共培养后MSC间间隙连接通讯（GJIC）变化；微孔隔离实验检测18a-甘草次酸（18a—GA）对MSC诱导的RPMI8226细胞迁移的影响。ELISA法检测共培养后的MSCSDF—1a分泌水平。结果MM细胞系RPMI8226、U266、1／3MM细胞及MM原代细胞CX43mRNA呈中、低度表达，XG-4、XG-7细胞不表达CX43。骨髓MSC高表达CX43。直接或间接共培养后骨髓MSC的CX43mRNA相对表达量明显提高，分别是单独培养时的1．36倍和2．10倍，Westernblot检测显示共培养后MSCCX43蛋白表达水平也上调，免疫荧光染色显示增高的CX43主要分布在胞质。划痕实验显示在MSC与RPMI8226直接共培养后荧光染料在细胞间扩散距离增加。MSC与RPMI8226细胞直接和间接共培养体系中，MSC培养上清SDF．1et水平分别为（373．02±10．11）和（309．714-10．71）pg／ml，高于共培养前[（237．84±9．23）pg／m1]（P〈0．01），该作用可被18a-GA抑制降为（126．01±4．80）和（106．99±3．39）pg／ml。18et—GA可抑制MSC诱导的RPMI8226细胞迁移，其作用前后RPMI8226细胞迁移率分别为（8．00--0．67）％及（4．82：50．19）％。结论MM细胞与MSC直接和间接共培养均可上调MSCCX43表达水平，并促进SDF—let的分泌。间隙连接阻断剂18et—GA可降低共培养体系中SDF—1a的分泌并抑制MSC诱导的MM细胞迁移。
- 张晓慧孙谕王子妍黄湛平傅晋翔
- 关键词：多发性骨髓瘤连接蛋白43
- 下调脐静脉内皮细胞小窝蛋白1表达对RPMI8226细胞硼替佐米敏感性的影响
- 2013年
- 目的探讨下调脐静脉内皮细胞（HUVEC）小窝蛋白1（Cav．1）表达对多发性骨髓瘤细胞硼替佐米敏感性的影响。方法构建靶向Cav-1基因的shRNA表达载体及阴性对照shRNA表达载体，转染HUVEC细胞株；以多发性骨髓瘤细胞系RPMl8226为对象，用MTT法检测不同浓度硼替佐米单独或联合50nmol／L地塞米松对单独培养及与HUVEC（转染干扰质粒或对照质粒）间接共培养的RPMl8226细胞增殖的抑制作用；用Western blot法检测Cav．1表达水平；用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡率及活性氧（P．OS）水平变化。结果Cav．1shRNA．1转染的HuVEc（HuVEc。low）Cav-1蛋白表达水平与转染阴性对照载体组相比显著降低，其Cav-1蛋白相对表达水平为0．2199±0．0288对1．3195±0．2393（P〈0．01）；RPMl8226细胞单独培养及与HUVEC、HUVEC共培养，硼替佐米作用的IC50值分别为20、50、65nmol／L。HUVEC、HUVEC可使RPMl8226细胞周期阻滞，RPMl8226细胞单独培养及与HUVEC、HUVEC共培养后RPMl8226细胞G0／G1期比例分别为28．5％、30．4％和36．2％；HUVEC保护RPMl8226细胞免于凋亡，20nmol／L硼替佐米作用于单独培养及与HUVEC、HUVEC共培养的RPMl8226细胞24h后，其细胞凋亡和（或）死亡率分别为66．8％、10．7％和8．6％；RPMl8226细胞可诱导HUVEC的氧化应激，共培养前后RPMl8226细胞ROS水平由15．0％上升至35．2％，HUVEC的ROS水平由80．4％上升至91．0％，HUVEC ROS水平由84．6％上升至96．8％。结论下调HUVECCav一1表达可促进共培养的RPMl8226细胞增殖，抑制细胞凋亡，使其阻滞在静息期，并降低RPMl8226对硼替佐米的敏感性。
- 陈露居颂光王子妍李军袁育青傅晋翔
- 关键词：人脐静脉内皮细胞多发性骨髓瘤硼替佐米
- 多发性骨髓瘤细胞株PRIM8226侧群细胞分选及其生物学特性的研究
- 2014年
- 目的 检测和分选多发性骨髓瘤（MM）细胞株PRIM8226中的侧群细胞（SP细胞）并鉴定其生物学特性.方法 以Hoechst33342/碘化丙啶（PI）荧光染料双染,维拉帕米拮抗对照,应用流式细胞术荧光激活分选法检测并分选MM细胞株PRIM8226 SP细胞,并通过细胞生长曲线、细胞周期、免疫表型、集落形成实验、RT-PCR检测干细胞特异标志物mRNA表达量、裸鼠体内成瘤实验等对SP细胞的生物学特性进行初步探讨.结果 MM细胞株PRIM8226 SP细胞含量为（1.78±0.89）％,采用流式细胞术成功分选SP细胞.生长曲线显示：SP细胞分选初期生长较主群细胞（MP细胞）缓慢,进入稳定增长期后增殖能力与MP细胞差异无统计学意义（P＞0.05）.细胞周期分析显示：SP细胞与MP细胞相比,周期多处于Go/G1期[（44.34±3.09）％、（28.49±1.97）％,P＜0.05],较少的细胞处于S期[（38.83±3.69）％、（51.49±4.62）％,P＜ 0.05].在免疫表型研究中,观察到SP和MP细胞的CD138、CD38表达分别为（78.5±8.5）％、（82.0±4.0）％和（72.3±15.7）％、（84.3±11.9）％,差异均无统计学意义（均P＞0.05）.MM细胞株PRIM8226 SP细胞的单细胞克隆直径、克隆形成数、克隆形成率均高于MP细胞[0.280±0.016和0.118±0.019、1 722±127和358±14、（86.1±3.46）％和（17.9±1.88）％,P＜0.05].RT-PCR显示SP细胞干细胞标志性基因的表达高于MP细胞：c-myc[（29.90±3.73）％、（16.84±2.35）％]、KIF4[（29.97±2.89）％、（19.06±1.23）％]、SOX2[（40.00±4.58）％、（16.62±2.09）％]、OCT4[（32.96±1.56）％、（23.27±0.92）％]（均P＜0.05）.裸鼠体内成瘤实验显示SP细胞成瘤能力显著高于MP细胞（最低成瘤数量分别为5×103、5×105个）.结论 MM细胞株PRIM8226的SP细胞在静止期细胞比例、集落形成能力、干细胞标记c-myc、KIF4、SOX2、OCT4基因表达量、体内成瘤能力上与MP细胞差异均有统计学意义,而SP细胞和MP�
- 黄湛平王子妍傅晋翔
- 关键词：多发性骨髓瘤肿瘤干细胞侧群细胞
- Cx43在造血调控及重建中的作用被引量：3
- 2019年
- 目的:采用条件性基因敲除技术构建造血系统间隙连接蛋白43(Cx43)基因敲除(Cx43^(-/-))小鼠模型,并探讨Cx43在维持造血细胞自我更新及功能稳定中的作用。方法:将引进的2对转基因小鼠Cx43 loxP/loxP和Lyz-Cre/+杂交,选取F1雌性子代Cx43 loxP/-_Lyz-Cre/+与雄性Cx43 loxP/loxP合笼回配,提取所获得子代小鼠鼠尾组织基因组DNA,采用PCR方法鉴定小鼠基因型,RT-PCR方法筛选Cx43^(-/-)小鼠,同时分析小鼠不同器官中Cx43基因的表达差异;该类小鼠经5-氟尿嘧啶(5-FU;125 mg/kg)处理,在化疗前及化疗后第5、10和15天经眼球取血分析其血象变化。Cx43^(-/-)及Cx43^(+/+)小鼠予7.5 Gy(^(60)Co-γ)的致死量照射,剂量率1 Gy/min,照射后6 h分别给予事先准备就序的骨髓细胞,每只3×10~6细胞于尾静脉注入,2周后处死小鼠检测造血是否重建:分离股骨切片后,收集骨髓细胞进行细胞表型分析(选用的单抗为CD45R、Gr-1、CD4、 CD8a、TCRαβ、Mac-1、抗sIgM、TER119、Sca-1及CD117);同时进行体外造血细胞集落实验观察造血细胞的体外增殖能力。结果:本研究通过2种转基因小鼠间杂交和回交,成功获得造血系统选择性Cx43基因敲除小鼠;该类小鼠骨髓及外周血细胞无Cx43表达,参与造血的组织,如肝脏和脾脏中Cx43表达也显著下调(P<0.01),而心脏和肾脏的Cx43表达则无影响,小鼠成年后外周血象分析并无明显异常,但应急代偿能力下降,经5-FU处理后,其造血功能恢复显著减缓,处理15 d后,Cx43^(+/+)小鼠造血功能已接近正常水平,而Cx43^(-/-)小鼠仍无明显的恢复迹象,血红蛋白、白细胞及血小板仍处低位,2者差别有统计学显著性(P<0.01);体外集落试验也证实Cx43^(-/-)小鼠造血干/祖细胞的增殖能力下降,其CFU-GM或CFU-E集落数均明显少于Cx43^(+/+)小鼠(P<0.01),但流式细胞术结果显示,Cx43^(-/-)小鼠骨髓中Lin^-/c-Kit^+/Sca-1^+细胞亚群数量与Cx43^(+/+)小鼠相比差异并无统计学显�
- 张阳敏罗筱衍徐燕霞周东明张立莹傅晋翔
- 关键词：间隙连接蛋白43造血调控造血重建
- 体外诱导自噬对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响被引量：1
- 2012年
- 目的探讨诱导自噬对多发性骨髓瘤（MM）细胞株增殖的影响。方法在无血清培养条件下诱导MM细胞株U266细胞自噬并分别加入雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤（3-MA），观察其细胞增殖，以正常培养条件培养U266细胞、淋巴瘤细胞株Jurkat及无血清培养Jurkat为对照组。采用CCK8法检测细胞的增殖；用流式细胞术检测细胞凋亡；单丹（磺）酰戊二胺（MDC）法检测细胞自噬泡数量；RT—PCR法检测自噬基因mtor、Beclinl表达；Westernblot方法分析自噬标志蛋白-微管相关蛋白轻链3Ⅰ／Ⅱ（LC3I／II）及溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）含量的变化。结果正常培养条件下U266细胞有基础水平的自噬，无血清培养可诱导U266细胞上调自噬水平；雷帕霉素促进无血清培养条件下U266细胞自噬并刺激其增殖能力，至培养96h无血清培养及雷帕霉素处理U266细胞内自噬水平下降；3-MA具有上调U266细胞自噬和促进增殖作用，但仅维持24h；正常培养条件下雷帕霉素及3-MA可显著抑制U266细胞增殖；无血清培养24h后细胞凋亡率[（17．90±1．46）％]高于正常培养细胞[（1．33±0．09）％]（P〈0．01）；加入雷帕霉素及3-MA可使血清饥饿诱导的细胞凋亡率分别降至（6．23±0．12）％和（6．97±0．03）％（P〈0．01）；培养至72h，各处理组细胞凋亡率趋于一致[（30．37±0．27）％、（30．13±1．93）％和（28．57±2．83）％]（P〉0．05）；去除雷帕霉素及3-MA后U266细胞凋亡率减低至18．7％和12．6％。结论MM细胞内存在高于淋巴瘤Jurkat细胞株基础水平的自噬；在常规培养条件下雷帕霉素及3-MA均可下调MM细胞增殖水平；血清饥饿条件下U266细胞可通过上调自噬水平维持生存和增殖；雷帕霉素诱导血清饥饿条件下U266细胞自噬，但是具有白限性；3-MA对U266细胞自噬具有双重作用。
- 高灵素张晓慧张宏张蕴玉陈露傅晋翔
- 关键词：多发性骨髓瘤雷帕霉素自噬
