国家自然科学基金(30070829)
- 作品数：8 被引量：25H指数：3
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- 相关机构：中山大学附属第一医院中山大学附属第三医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人热休克转录因子1功能反应与其半胱氨酸巯基氧化还原性能的相关性被引量：1
- 2003年
- 目的 评价半胱氨酸巯基氧化还原介导剂对人热休克转录因子 1(hHSF1)的氧化还原状态、结构和功能的作用 ,并试图去解释氧化作用在细胞衰老中对hHSF1转录反应的影响。 方法 通过改良的Westernblot方法检测不同氧化还原介导剂对hHSF1构象的影响 ;通过凝胶电泳迁移率变动试验检测hHSF1的DNA的结合活性。 结果 促进二硫键交联的氧化型介导剂二酰胺(DM )、一氧化氮 (NO+ )载体亚硝基谷胱甘肽 (GSNO)与含hHSF1的HeLa细胞S10 0提取液预培育 ,能在体外形成一个致密的、电泳中移动快速、分子内二硫键交联的氧化型hHSF1(ox hHSF1)单体构象 ;在电泳前加入还原型介导剂二硫苏糖醇 (DTT)能完全逆转。由于ox hHSF1形成 ,使hHSF1在体外不能被热诱导激活形成三体 ,失去和DNA结合的活性 ,而且这个作用仅对含半胱氨酸巯基的转录因子有特异性。 结论 hHSF1功能反应与其半胱氨酸巯基的氧化还原化学性能相关 ,氧化作用和hHSF1分子内二硫键交联有可能是衰老细胞热休克转录反应呈渐减性的原因。
- 林正马中富黄帆徐康LIU Alice YC
- 关键词：衰老细胞
- 抗热休克蛋白72多克隆抗体血清的制备和检测被引量：5
- 2006年
- 目的探讨在大肠杆菌中表达人热休克蛋白72(hHSP72)与组氨酸(His)的融合蛋白并制备其抗体血清的方法。方法将hHSP72片断插入His融合表达载体pPROEX1TM,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得His hHSP72融合蛋白。采用纯化后的HSP72免疫新西兰白兔,制备抗血清;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测重组抗原的免疫活性。结果重组质粒酶切鉴定结果表明,hHSP72基因已正确插入到pPROEX1TM中,经IPTG诱导后,表达出分子质量约为73ku的蛋白,获得了效价为1∶100000的多克隆抗体。Western blot检测证明,所制备的多克隆抗体可以与hHSP72特异性结合,其效价高于市售的单克隆抗体。结论用hHSP72片断在大肠杆菌中能成功表达,并能制备得到多克隆抗体;这种多克隆抗体是一种新的高特异性和高灵敏度的试剂。
- 黄帆徐康吴兴刚马中富林正
- 关键词：热休克蛋白72多克隆抗体
- 还原型Western blot方法检测人热休克转录因子1的氧化还原构像被引量：1
- 2003年
- 目的 分辨、检测人类热休克转录因子 1 (hHSF1 )的氧化还原构像 ,以了解构像的改变对其功能的影响。方法 建立了一种新型的还原型Westernblot检测法 ,使已形成稳定屏障式抗原核心 ,双硫键交联的氧化型人类热休克转录因子 1 (ox -hHSF1 )还原 ,恢复其免疫检测活性。结果 无论在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的还原型Westernblot中都可检测出一个在常规不能检测出的、移动快速、结构致密、分子内双硫键交联的ox hHSF1构像。ox hHSF1的出现 ,使hHSF1在体外不能被热诱导激活形成三体 ,失去其与DNA结合的功能。结论 还原型Westernblot的建立 。
- 林正马中富黄帆徐康
- HSF1中的半胱氨酸残基氧化还原状态对其功能的调节被引量：2
- 2005年
- 人热休克转录因子1(heatshocktranscriptionfactorl ,HSF1)的结构和功能与其半胱氨酸残基的氧化还原化学性能相关.为了鉴别在氧化还原状态改变时参与分子内双硫键交联的HSF1半胱氨酸残基,了解其氧化还原化学性改变在生物学调节中的重要性,通过建立和应用重组人HSF1中的5个半胱氨酸突变体和1个双重突变体,并用已知的巯基氧化介导剂联氨(diamide ,H2 N·NH2 )和还原介导剂二硫苏糖醇(DTT)与在体外转录和翻译的HSF1突变体蛋白质预孵育,观察其构象和与DNA结合活性的改变.结果显示,与野生型一样,所有的HSF1半胱氨酸突变体都能被热激活并与DNA结合;联氨预处理能阻断这种作用,但对突变体C153 S和双重突变体C3 73、3 78S无效.氧化还原状态对HSF1构象改变显示联氨能使HSF1野生型和突变体C3 6T和C10 3 Y形成氧化型HSF1(ox HSF1)构象,但对C153 S和C3 73、3 78S双重突变体不起作用,而单一突变体C3 73 S或C3 78S在联氨作用下分别形成二种分子量稍不同的ox HSF1构象.结果提示,在氧化条件下HSF1中的半胱氨酸残基C153 可能与C3 73 或与C3 78形成分子内二硫键交联;在对抗氧化作用上,C153 和C3 73 、C3 78起着“关闭性”作用,预防了HSF1的激活.
- 林正黄帆罗兰张式鸿马中富吴兴刚徐康
- 脑梗死患者外周血单个核细胞SOCS-3动态变化及临床意义被引量：9
- 2008年
- 目的探讨脑梗死患者外周血单个核细胞（PBMC）中细胞因子信号转导抑制因子-3（SOCS-3）表达规律及其临床意义。方法实时荧光定量PCR法检测脑梗死患者PBMC中SOCS-3mRNA表达，酶联免疫吸附法（ELISA）检测脑梗死患者血样中血浆白介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。记录所有患者发病3d内影像学（CT／MRI）脑梗死体积。观察并记录患者入院48h内及发病三月时的神经功能缺损评分。结果（1）脑梗死患者发病后1-6dPBMC中SOCS-3mRNA表达显著高于对照组（P〈0．05），其表达随时间延长呈下降趋势，至第7、14天时与对照组无显著差异。（2）进展型脑梗死患者发病后第1天PBMC中SOCS-3mRNA表达显著低于完全型脑梗死患者，但较对照组高（P〈0．05）；其血浆中IL-6及TNF-α水平则显著高于完全型脑梗死患者。（3）梗死体积大小不同组患者发病后第1天PBMC中SOCS-3mRNA表达无显著差异（P〈0．05）；血浆中IL-6及TNF-α水平含量高低与梗死体积呈正相关。（4）脑梗死患者发病三月时改良Rankin量表（mRS）评分与发病第l天SOCS．3mRNA表达呈负相关。与血浆IL-6、TNF-α呈正相关。结论脑梗死患者急性期PBMC中SOCS-3参与脑梗死发生、发展的病理生理过程。提示JAK／STAT／SOCS-3这条信号通路可能通过抑制炎症细胞因子的表达从而减轻脑缺血后炎症反应．改善神经功能缺损．成为内源性的神经保护机制之一。
- 黄帆杨静仲飞马中富林正
- 关键词：脑梗死细胞因子信号转导抑制因子-3实时荧光定量PCR
- 衰老细胞中热休克转录因子1的异常调节和定位被引量：3
- 2006年
- 为评估人热休克转录因子1(HSF1)在衰老细胞中呈现年龄依赖功能失调机制,通过凝胶电泳迁移率改变实验(EMSA)和RNA酶保护实验等了解低总体倍增水平(PDLs)的年轻和高PDLs的衰老IMR90双倍体人肺纤维母细胞的HSF1 DNA结合活性、HSF1蛋白质及其编码转录子mRNA水平和亚细胞分布.使用H2O2诱导年轻IMR90细胞成为“应激诱导早熟性老化(SIPS)”细胞,并与复制性衰老细胞比较HSF1 DNA结合活性、HSF1亚细胞分布和细胞内过氧化物含量.在不同年龄的IMR90细胞中,无论体内或体外,HSF1激活能力与细胞年龄呈反相关,但细胞内HSF1蛋白质与其mRNA水平并无改变.HSF1的亚细胞定位分析显示,HSF1主要存在于年轻细胞胞质中,热刺激促使三体形成和核转移;而在衰老细胞中,37℃时HSF1大部分存在于细胞核内,热刺激后形成三体,与DNA结合能力明显比年轻细胞弱;用H2O2诱导的应激成熟前老化细胞内,HSF1功能和亚细胞分布都与复制性衰老细胞相似.结果显示,细胞年龄与HSF1的激活和定位相关,而与HSF1含量无关,这些变化可能是通过氧化修饰所致.
- 林正张式鸿罗兰黄帆吴兴刚徐康马中富
- 关键词：热休克转录因子1衰老
- 谷胱甘肽合成抑制对人热激因子1结合DNA功能的影响被引量：1
- 2003年
- 【目的】研究细胞内具抗氧化作用的谷胱甘肽合成受抑制对人热激因子1结合DNA功能的影响。【方法】用谷胱甘肽合成酶抑制剂丁硫堇处理培养中的HeLa细胞,降低细胞内的谷胱甘肽水平,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot检测细胞谷胱甘肽缺乏时经热激处理后人热激因子1的氧化还原构象改变;通过凝胶电泳迁移率试验检测其与DNA结合的活性变化。【结果】丁硫堇处理后的HeLa细胞,经热激后出现一种在电泳中移动快速、结构致密、分子内二硫键交联的氧化型热激因子1;凝胶电泳迁移率试验结果显示热激因子1与DNA结合活性降低。【结论】谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原状态中起重要作用,谷胱甘肽缺乏导致细胞内氧化型热激因子1蓄积,从而降低热激因子1与DNA结合的功能。
- 林正罗兰张式鸿徐康
- 关键词：谷胱甘肽
