国家自然科学基金(30470053)
- 作品数：6 被引量：18H指数：4
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- 假单胞菌生物合成L-半胱氨酸途径中脱巯基酶的研究被引量：1
- 2006年
- 通过PCR方法扩增得到假单胞菌TS1138L-半胱氨酸脱巯基酶基因(cd),将其克隆至pBluescript SKII载体,测定了含有L-半胱氨酸脱巯基酶基因的1·2kb DNA片段序列,并与其它菌株的脱巯基酶基因进行了同源性比较;同时,将其克隆至表达载体pET-21a(+),IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA柱亲合层析后,得到纯化的重组蛋白。利用脱巯基酶的活性染色方法对重组表达的L-半胱氨酸脱巯基酶进行了鉴定,并探讨了L-半胱氨酸脱巯基酶的酶学性质,以及在生物转化合成L-半胱氨酸途径中的关键作用。
- 余养盛李洋金永杰白钢杨文博
- 关键词：L-半胱氨酸脱巯基酶假单胞菌基因克隆酶学性质
- 假单胞菌TS1138 L-半胱氨酸脱巯基酶基因的克隆与表达被引量：2
- 2006年
- 提取假单胞菌TS1138染色体基因,以自行设计的引物通过PCR方法扩增得到L-半胱氨酸脱巯基酶基因(cds),将其克隆至克隆载体pBluescript SKⅡ,并转化入大肠杆菌DH5α,测定了含有脱巯基酶基因(cds)的1．2 kb DNA片段的序列；同时,将其克隆至表达载体pETH,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,重组蛋白量占菌体总蛋白的36．8%,经Ni-NTA柱亲合层析后,重组蛋白纯化率达88%以上．用非变性PAGE方法对基因表达的脱巯基酶进行了鉴定．
- 白钢李洋余养盛杨文博游松刘忠孙丹
- 关键词：L-半胱氨酸脱巯基酶假单胞菌基因克隆
- 假单胞菌TS-1138 L-半胱氨酸脱巯基酶的纯化和性质研究被引量：5
- 2004年
- 假单胞菌TS-1138L-半胱氨酸脱巯基酶经DEAECellulose-52阶段洗脱、SephadexG-100柱层析被纯化了80.3倍,SDS-PAGE鉴定为单一条带,该酶的相对分子质量为53.0kDa;酶反应的最适pH为7.5,最适反应温度为35℃,该酶的米氏常数为2.37μmol/L,最大反应速度为0.11μmol/mL·min·Pb2+对该酶有很强的激活作用,Zn2+对该酶有较强的抑制作用,羟胺为该酶特异性的抑制剂.
- 金永杰杨文博刘忠白钢孙丹
- 关键词：L-半胱氨酸脱巯基酶假单胞菌酶纯化酶性质
- L-半胱氨酸产生菌恶臭假单胞菌TS1138的鉴定和诱变育种被引量：4
- 2007年
- 从土壤中分离得到一株利用DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸合成L-半胱氨酸的TS1138菌株,通过形态学特征、生理生化特征、(G+C)(摩尔分数)和16S rRNA基因序列对其进行了分类鉴定,确定TS1138菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida).该菌株具有将DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸不对称地水解生成L-半胱氨酸的性能.采用了L-半胱氨酸产物的检测方法即18-磷钨酸法、薄层层析法和旋光度法.将TS1138菌株进行亚硝基胍诱变,得到TS1138菌株脱巯基酶缺失突变株TS1138-10,其产L-半胱氨酸能力较出发菌株提高了5000/以上.TS1138-10的稳定性实验表明,该菌株的高产L-半胱氨酸能力具有稳定性的遗传特性.
- 孙丹余养盛杨文博田旺白钢
- 关键词：L-半胱氨酸
- 恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究被引量：6
- 2008年
- 对以DL-2-氨基-△^2-噻唑啉-4-羧酸（DL-2-amino-A2thiazoline-4-carboxylic acid，DL—ATC）为底物原料，经微生物酶法催化合成L-半胱氨酸，并进一步氧化和分离纯化产物L-胱氨酸的生产工艺和条件进行了研究。建立了以恶臭假单胞菌TS1138（Pseudomonas putida TS1138）全细胞为酶源，反复多次催化底物合成L-半胱氨酸，并以2．0％二甲基亚砜（DMSO）为氧化剂氧化生成L-胱氨酸，进而通过001×7型阳离子交换树脂纯化胱氨酸的新工艺。采用高效液相色谱法考察该方法L-胱氨酸的总收率可以达到78．55％，纯度为99．12％。该方法简单高效，解决了酶稳定性差不能重复使用，而固定化酶方法繁琐成本高的问题，为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径。
- 刘春琴余养盛白钢杨文博陈宁怀立华
- 关键词：恶臭假单胞菌DL-ATCL-半胱氨酸L-胱氨酸生产工艺
- NaCS-PDMDAAC微胶囊固定化假单胞菌TS-1138从ATC合成L-半胱氨酸被引量：6
- 2005年
- 采用非均相反应制备NaCS(硫酸纤维素钠),考察了反应液中正丙醇-硫酸的最佳比例为25∶35,NaCS和PDMDAAC的最适滴制浓度分别为4%和3%;利用NaCS-PDMDAAC微胶囊对假单胞菌TS-1138进行固定化并进行连续培养,结果表明,菌体能在胶囊内很好的生长和繁殖,连续培养132h后菌浓可达到4.5×1011个/mL胶囊,是在相同条件下游离培养的6倍;固定化菌体以ATC为底物生成L-半胱氨酸的催化活性是游离培养菌体的2.5倍,并且固定化菌体的重复使用能力明显优于游离菌体.重新考察固定化菌体的最适催化反应时间为3h,在一定程度上弥补了微胶囊传质性相对较差的不足.
- 金永杰杨文博刘忠白钢李洋余养盛孙丹
- 关键词：固定化假单胞菌L-半胱氨酸
