四川省卫生厅科研基金(070137)
- 作品数：3 被引量：5H指数：1
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- 不可分型流感嗜血杆菌Hap基因的克隆及原核表达被引量：1
- 2009年
- 构建不可分型流感嗜血杆菌(Non-typeable Haemophilus influenzae,NTHi)Hap基因的原核表达载体,并诱导其表达Hap融合蛋白。以NTHi标准株ATCC49247基因组DNA为模板扩增出Hap目的基因片段,双酶切后连接于原核表达载体pET-32a(+),构建Hap重组原核表达质粒pET-32a(+)-Hap,将经PCR、酶切及DNA测序鉴定正确者转化E.coliBL21(DE3),诱导表达带有His标签的Hap融合蛋白。SDS-PAGE电泳分析重组蛋白的相对分子量大小及表达形式,Western blot进一步鉴定表达产物的特异性。通过PCR成功扩增出NTHi Hap基因,构建了具有正确基因序列的Hap原核表达质粒pET-32a(+)-Hap,SDS-PAGE电泳分析成功表达出相对分子量(Mr)为176000的重组融合蛋白,该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot结果表明该重组融合蛋白可与抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合。NTHi Hap蛋白在原核表达系统中的成功表达,将为Hap蛋白免疫活性的深入研究及NTHi新型保护性疫苗的开发奠定实验基础。
- 李婉宜邝玉姚锋杨远陈长春蒋忠华李明远
- 关键词：不可分型流感嗜血杆菌原核表达
- 不可分型流感嗜血杆菌重组Hap蛋白免疫抗小鼠急性感染的实验研究被引量：1
- 2010年
- 目的：观察重组Hap蛋白免疫抗不可分型流感嗜血杆菌（NHTi）感染的免疫保护效果，初步探讨其保护机制。方法：用纯化的Hap重组蛋白与黏膜免疫佐剂霍乱肠毒素B亚单位（CT-B）联合鼻腔免疫C57BL／6小鼠。NHTi琼脂珠悬液对免疫小鼠进行气管内注射，建立小鼠NHTi急性肺部感染模型。NHTi攻击5d后，收集实验小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）进行白细胞计数，并取其肺组织进行肺部荷菌数检测及肺组织的病理检测。结果：Hap重组蛋白与CT—B的联合免疫能显著降低小鼠BALF中的白细胞总数、中性粒细胞渗出（P〈0．05）及感染小鼠肺组织内NTHi的荷菌数，并减轻感染小鼠支气管、细支气管周围及肺泡内的炎性浸润程度，明显改善其肺组织的病变。结论：鼻腔免疫的Hap重组蛋白在动物体内能发挥良好抗NTHi感染的免疫保护作用，为NTHi新型疫苗的研发提供了理论基础和实验依据。
- 李婉宜王保宁左凤琼曾蔚丰锋邝玉蒋中华李明远
- 关键词：黏膜免疫
- 不可分型流感嗜血杆菌重组Hap蛋白的表达及其生物学活性分析被引量：3
- 2010年
- 目的在原核系统中表达并纯化不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)的重要粘附因子Hap蛋白,并对其免疫原性和粘附活性进行初步研究。方法 IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Hap在E.coliBL21中高效表达,Ni2+亲和层析柱纯化表达产物。用纯化的Hap重组蛋白进行体外竞争黏附实验,SEM观察及菌落形成单位计数法分析该重组蛋白的黏附活性。纯化蛋白与黏膜免疫佐剂CT-B联合鼻腔免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠抗Hap的IgA及IgG抗体水平。结果纯化产物的SDS-PAGE分析显示获得单一的目的蛋白条带,Gelanalysis软件分析蛋白纯度可达85%,纯化产物超滤浓缩后,测得其蛋白浓度为3.2g/L。体外竞争黏附实验观察到Hap重组蛋白的加入可明显抑制NTHi对胞外基质的黏附,且细菌黏附量的减少与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。该重组蛋白与免疫佐剂CT-B联合免疫小鼠,可刺激机体产生较高水平的IgG或IgA抗体,与重组抗原单独免疫组相比,差异具有显著性(P<0.05)。结论 Hap蛋白在原核系统中获得较高浓度和纯度的表达,纯化Hap重组蛋白具有良好的免疫原性和粘附活性。
- 姚锋李婉宜邝玉李明远丰锋冯伟张强
- 关键词：不可分型流感嗜血杆菌免疫原性粘附活性
