国家自然科学基金(103055)
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
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- 相关机构：中山大学华中科技大学吉林大学更多>>
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- 严密型四环素调控系统调控的表达HCV-C基因双转基因小鼠模型的建立被引量：1
- 2008年
- 目的制备严密型四环素调控系统调控下表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的双转基因小鼠,为进一步阐明核心蛋白Core与HCV感染所致的疾病以及与肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法严密型四环素调控部分(ApoE-rtTA-tTS)转基因阳性鼠和反应部分(TRE-HCV-C)转基因阳性鼠交配产生仔鼠,经PCR和Southern blot分析筛选出阳性鼠,免疫组织化学检测HCV-C蛋白双转基因小鼠肝组织内表达情况及其肝脏的病理变化。结果得到了2只携带有两种基因(tTS和HCV-C)的双转基因小鼠,成功制备了严密型四环素调控系统的HCV-C双转基因小鼠。结论结果表明,所建立的严密型四环素调控系统在动物模型中是可行的和有效的,它消除了普通四环素调控系统存在的本底泄漏表达的缺点,是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。
- 帅丽芳唐博恒张若霜赵勇杨国柱陈系古
- 基于四环素调控系统的ApoE-rtTA/TRE-HCV-C双转基因小鼠的制备被引量：1
- 2007年
- 目的为了丰富现有的四环素调控系统的小鼠资源库,同时也为更好地研究目的基因HCV-C的作用机制提供一个活体的动物模型,制备基于四环素调控系统原理的调控部分ApoE-rtTA的转基因小鼠,与反应部分TRE-HCV-C转基因小鼠,相互交配制作出双转基因小鼠。方法应用显微注射法将构建好的两种基因片段ApoE-rtTA及TRE-HCV-C分别注入超排的昆明母鼠的受精卵,再植入假母输卵管,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,将两者及阳性后代交配产生携带5只转基因鼠再经Western blot和RT-PCR在RNA和蛋白水平上进一步鉴定。结果产生了3只整合有ApoE-rtTA基因的首见鼠和125只阳性子代,以及产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首见鼠和16只阳性子代。PCR及Southern Blot证实上述阳性鼠确有转基因整合。将两者交配产生携带5只双转基因鼠。结论成功制备了携带有ApoE-rtTA及TRE-HCV-C转基因小鼠,建立了分别携带有这两种基因的鼠群,以及同时携带有两种基因的双转基因小鼠,为四环素调控系统提供了一个良好的通用型的调控动物模型,同时也可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。
- 杨国柱陈系古黄冰单于肖东马芸邓新燕
- 关键词：载脂蛋白转基因鼠
- 表达丙肝病毒核心蛋白基因的人肝细胞模型的建立被引量：1
- 2003年
- 目的 构建表达丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCV C)基因的人肝细胞模型。方法 用聚合酶链反应 (PCR)方法从 pHCV MA质粒中钩出HCV C基因 ,酶切纯化后克隆于质粒 pTRE中 ,建立重组质粒 pTRE C。pTRE C经酶切、纯化后目的片段与质粒PcDNA3连接 ,通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒PcDNA3 tRe C ,由脂质体介导转染Chang liver人肝细胞 ,建立表达HCV C基因的人肝细胞模型 ,PCR方法鉴定Chang liver人肝细胞内HCV C基因 ,反转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测HCV C基因在Chang liver人肝细胞内的表达 ,抗生物素蛋白 生物素 过氧化物酶复合体法 (ABC法 )方法分析HCV核心蛋白在人肝细胞内的表达及定位。结果 构建了表达HCV C基因的重组真核表达载体 ,并在Chang liver人肝细胞中表达出HCV C蛋白。结论 成功地建立了表达HCV C基因的人肝细胞模型 ,该模型为进一步研究HCV C的生物学特性及HCV感染所致肝硬化、肝癌的致病机制提供基础材料。
- 单于陈系古黄冰胡安斌郭中敏赵宁
- 关键词：聚合酶链反应丙型肝炎病毒感染C蛋白
- 丙型肝炎病毒核心蛋白基因表达致人肝细胞恶性转化的研究被引量：4
- 2004年
- 丙型肝炎病毒核心 (HCV C)蛋白是维持丙型肝炎病毒结构的重要蛋白质 ,由于参与调节细胞的生长与凋亡 ,被认为与HCV感染所致的肝硬化及肝细胞癌的发生有关 .为了进一步探索HCV C蛋白与肝细胞癌发生的关系 ,首先构建了表达HCV C蛋白的真核表达载体 ,脂质体介导转染Chang liver人肝细胞株 ,建立表达HCV C蛋白的人肝细胞模型 ,RT PCR方法检测HCV C基因在人肝细胞内的表达 ,蛋白质印迹和免疫细胞化学方法鉴定Chang liver肝细胞内HCV C蛋白及其在细胞内的分布情况 .表达HCV C蛋白的Chang liver人肝细胞培养 2 0代以后 ,与对照组细胞相比 ,细胞的形态出现长梭形样改变 ,生长速度显著加快 ,细胞内DNA含量的均一性变差 .接种表达HCV C蛋白的Chang liver人肝细胞的 6只裸鼠在第 2 0天时全部有肿瘤长出 ,且肿瘤组织结构符合肝细胞癌病理形态特点 ,对照组裸鼠未见肿瘤生长 .上述结果表明HCV C基因表达可导致Chang liver人肝细胞发生恶性转化 ,提示HCV C蛋白与HCV感染所致肝细胞癌的发生有直接关系 .
- 单于陈系古黄冰胡安斌郭中敏黄文革
- 关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白基因表达肝细胞恶性转化
- 严密型四环素调控系统转基因首建鼠的建立
- 2008年
- 目的制备ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠1,为严密型四环素调控系统的体内研究提供调控部分的转基因小鼠,以便与反应部分小鼠交配得到双转基因小鼠。方法重组构建含目的基因的质粒pApoE-rtTA-tTS,应用显微注射法将其注入母鼠的受精卵,再植入代母输卵管,出生小鼠经PCR初步筛选出阳性,再经Southern杂交对阳性小鼠基因组DNA标本进一步鉴定。结果产生了2只整合ApoE-rtTA-tTS基因的首建鼠。结论成功制备了ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠,为下一步建立严密型四环素调控系统的双转基因小鼠模型奠定了基础。
- 帅丽芳张若霜邓新燕赵勇孙金海唐博恒陈系古
- 关键词：显微注射
- tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究被引量：5
- 2006年
- 【目的】构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型。【方法】通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素(1mg/L)诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆。【结果】带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株(192︰21),其中克隆9的诱导倍数最高(256),获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株。【结论】荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性。
- 张若霜帅丽芳赵勇陈系古
- 关键词：HEPG2细胞
- 携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达
- 2012年
- 目的构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达。方法以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP。PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况。以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度。结果成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8×104CFU/ml病毒滴度的重组病毒。结论成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清。
- 赵宁邓新燕单于郭中敏
- 关键词：EGFP基因
