天津市自然科学基金(013611011)
- 作品数：8 被引量：10H指数：2
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- 相关机构：天津市泌尿外科研究所中国科学院遗传与发育生物学研究所天津医科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 异种移植血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠的建立被引量：2
- 2005年
- 目的建立用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术,将含有人ICAM-2启动子、人CD59基因第1个内含子、人CD59 cDNA、BGH polyA终止信号的外源基因导入小鼠受精卵的原核中,选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链反应(PCR)及Southern blot确定外源基因整合阳性转基因小鼠。流式细胞术用于外源基因蛋白质水平表达检测。免疫组织化学方法观察人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官表达分布情况。结果产仔130只,9只外源基因整合阳性,整合率6％(9／130)。6只获得蛋白质水平表达,蛋白质水平表达强度为人CD59在人白细胞表达强度的80％至95％,转基因效率5％(6／130)。免疫组织化学检测显示人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏组织有较强表达,且表达限于血管内皮细胞。结论成功地建立了用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。
- 张志宏马腾骧王广有张月李胜芝李光三刘思金劳为德
- 关键词：异种移植排斥反应补体调节蛋白CD59转基因小鼠
- 人CD59重组基因在猪血管内皮细胞中的表达被引量：3
- 2004年
- 目的 通过转基因技术使猪的血管内皮细胞表达人CD5 9蛋白。方法 体外培养猪血管内皮细胞 ,脂质体转染法将pcDNA3 ICAM 2 Enhancer CD5 9cDNA、pcDNA3 ICAM 2 CD5 9cDNA及 pcDNA3 CMV CD5 9cDNA转染猪的血管内皮细胞 ,以未转染的猪血管内皮细胞为阴性对照 ,人的红细胞为阳性对照 ,经G418筛选 (浓度为 10 0mg/L)获得具有抗性的克隆 ,通过流式细胞仪检测转染细胞的表达情况。结果 pcDNA3 ICAM 2 Enhancer CD5 9cDNA重组质粒阳性表达强度为 61.4% ,对照组为 1.7% ,在成纤维细胞中为 8.2 %。不带增强子质粒为 3 8.3 %。结论 以人细胞间黏附因子Ⅱ (ICAM 2 )为启动子并带增强子的CD5
- 李胜芝姚旭东王广有马腾骧张泽张玥
- 关键词：内皮细胞基因表达CD59基因脂质体转染法
- 小鼠血管内皮细胞表达人DAF和CD59对其心脏在人血清灌注下做功的影响
- 2007年
- 目的探讨联合转入衰变加速因子(DAF)和CD59基因对小鼠心脏在人血清灌注下做功及组织结构的影响。方法采用受精卵显微注射技术,将人DAF和CD59基因注入昆明小鼠受精卵的原核中,选取注射后仍健康的受精卵植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。提取足月产小鼠(G_0代)基因组DNA,以聚合酶链反应(PCR)及Southern印迹杂交确定外源基因整合情况,应用流式细胞术检测人DAF和CD59在转基因小鼠白细胞上的表达,免疫组织化学染色检测人DAF和CD59在转基因小鼠心脏、肝脏及肾脏组织中的表达。取出转基因成功小鼠的心脏,在体外以人血清进行灌注,测定其做功能力,HE染色及免疫组化染色观察灌注后心脏的组织学变化以及补体C3c的沉积情况。以单一转DAF基因的小鼠为对照。结果共获得G_0代小鼠135只,经PCR及Southern印迹杂交分析,11只(8.1%,11/135)整合有人DAF和CD59外源基因,其中6只的白细胞膜表面人DAF和CD59表达阳性,强度分别为(86±6)%和(85±8)%,单转人DA F基因者(87±7)%,差异无统计学意义。人DAF及CD59仅表达于转基因小鼠心脏、肝脏及肾脏组织中的血管内皮细胞上。在人血清灌注后60min内,普通小鼠的心脏做功急剧下降,接近40min时心脏停止搏动;转DAF基因小鼠的心脏做功也下降,但仍维持在最大值的20%以上;转DAF和CD59双基因小鼠的心脏做功维持在最大值的40%以上。在人血清灌注的10～60min,转基因小鼠心脏做功能力明显强于普通小鼠心脏(P<0.05);灌注20～60min时,转双基因小鼠的心脏做功能力明显强于转DAF基因小鼠心脏(P<0.05)。普通小鼠心脏在人血清灌注后组织裂解较多见,肿胀严重,而转基因小鼠心脏组织的病理改变明显轻于普通小鼠,转双基因者的病理变化又明显轻于单一转DAF者,心肌血管中人C3c的沉积也明显少于单一转DAF者。结论血管内皮细胞特异性表达人DAF和CD59,可明显阻抑其心脏在�
- 张志宏马腾骧王广有李胜芝张月刘思金劳为德李光三
- 关键词：小鼠做功
- 使用人粘附分子-2启动子的衰变加速因子重组基因表达载体的构建及意义被引量：1
- 2001年
- 目的 :构建含人粘附分子 -2(ICAM -2)启动子的人衰变因子 (DAF)重组基因的真核细胞表达载体 ,运用于转基因动物克服异种器官排斥的研究。方法:双酶切本室已构建质粒pGEM -7Zf-DAF ,得到含人ICAM -2启动子及DAFcDNA序列的插入片段 (3.7Kb) ;双酶切pcDNA3真核表达载体 ,得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段DNA作为载体序列 (4.4Kb) ;两段DNA进行连接反应后转化细菌 ;阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。根据人的ICAM -2启动子、DAFcDNA序列 ,设计引物行PCR特异扩增检验。结果:特异性3组酶切重组表达载体 ,产生符合设计的相应条带 ;PCR扩增出特异的318bp及1.7Kb的DNA片段 ,符合设计要求。结论 :含人ICAM
- 姚旭东马腾骧张泽李志欣李胜芝张玥王广有
- 关键词：异种器官移植衰变加速因子基因重组
- 血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因小鼠传代及表达检测被引量：1
- 2004年
- 目的 :探讨外源基因在转基因动物中的遗传规律。方法 :将血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因昆明种雄性小鼠 ,与普通昆明种雌性小鼠交配。Southern -blot杂交确定子一代外源基因整合阳性转基因小鼠。RT -PCR方法用于子一代转基因小鼠人CD59转录水平筛选。以流式细胞术检测人CD59基因在子一代转基因小鼠蛋白质水平表达。结果 :产子14只。7只外源基因整合阳性 ,其中雄性4只 ,雌性3只。转录水平检测发现3只出现所需的条带。继而对上述3只转录水平阳性的F1代小鼠白细胞行流式细胞术检测 ,白细胞膜表面人CD59表达均阳性。结论 :转基因动物的遗传规律复杂 。
- 张志宏马腾骧王广有李胜芝张月李光三刘思金劳为德
- 关键词：转基因动物
- 血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠抗超急性排斥反应能力
- 2007年
- 目的:检测血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠抗超急性排斥反应能力。方法:采用Langendorff心脏灌注装置,用20%稀释人血清灌注转基因小鼠离体心脏,观察其抗超急排斥反应能力。免疫组化方法检测灌注后心脏组织人IgM沉积情况。结果:与普通鼠对比,转基因小鼠离体心脏在用20%稀释人血清灌注期间心脏存活时间明显延长,且60min灌注期间内做功仍维持在最大值20%以上,显示转基因小鼠具有一定抗超急排斥反应能力。免疫组化显示C3c(免疫组化一抗)在转基因组心肌组织间、血管管壁仅有少量沉积,普通小鼠组大量沉积,显示普通小鼠心脏遭受较为强烈的超急排斥反应损伤。结论:血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠有一定的抗超急排斥反应能力。
- 张志宏马腾骧王广有张玥李胜芝李光三刘思金
- 关键词：异种移植排斥反应转基因CD59内皮细胞小鼠
- 建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子的转基因小鼠被引量：3
- 2005年
- 目的为了研究异种移植,建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子(DAF)的转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术,将含有人内皮细胞粘附分子-2(ICAM-2)基因启动子、人DAFcDNA(插有人DAF基因第一个内含子)、SV40splice/polyA的外源基因导入小鼠受精卵的原核中;选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链(PCR)技术及Southern印迹杂交法确定外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法和流式细胞术分别用于外源基因mRNA及蛋白质水平表达的检测。免疫组织化学方法观察人DAF在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官的表达分布。采用Langendorff心脏灌流装置,用200g/L的稀释人血清灌注转基因小鼠离体心脏,检测其抗超急性排斥反应能力。结果共产仔鼠133只,21只整合有外源基因,整合率16%(21/133)。8只实现mRNA及蛋白质水平表达,蛋白质水平表达强度为人DAF基因在人白细胞表达强度的70%至95%,转基因效率6%(8/133)。免疫组织化学法显示人DAF在转基因小鼠器官组织切片上有较强表达,且表达限于血管内皮细胞。与普通鼠对比,转基因小鼠离体心脏存活时间明显延长,且60min灌注期间内做功仍维持在最大值20%以上。结论成功地建立了血管内皮细胞组织特异性表达人DAF的转基因小鼠。这种小鼠有一定的抗超急性排斥反应能力。
- 张志宏马腾骧王广有张月李胜芝李光三刘思金劳为德
- 关键词：组织特异性表达血管内皮细胞转基因小鼠LANGENDORFF内皮细胞粘附分子RT-PCR方法
- 异种移植转基因用含粘附分子-2启动子的人CD59重组基因的构建
- 2002年
- 目的构建含人粘附分子-2(ICAM-2)启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并将其用于异种器官移植转基因。方法利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM-2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离、切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM-2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化菌质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细胞,流式细胞仪检测CD59蛋白表达。结果得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoRⅠ消化此重组质粒,产生5.5及0.5kb两片段;以HindⅢ消化重组质粒,得到5.45及0.55kb两片段,以KpnⅠ/HindⅢ双酶切质粒时,出现5.0、0.55、0.4kb3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列。流式细胞仪检测重组基因表达阳性。结论含人ICAM-2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础。
- 姚旭东马腾骧吴志宏李胜芝李志欣王广有
- 关键词：异种移植启动子转基因
