重庆市自然科学基金(CSTC2009JJ0305)
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- 磁共振报告基因magA的慢病毒载体质粒构建及体外表达
- 2011年
- 目的构建携带磁共振报告基因magA的慢病毒载体质粒,初步检测其体外转铁效应。方法采用人工DNA合成技术合成目的基因magA,DNA重组技术将magA基因连接入慢病毒表达载体质粒pLenti-EGFP,酶切及DNA测序鉴定重组质粒pLenti-EGFP/magA的准确性。包装、包膜及重组质粒共转染293FT细胞包装慢病毒,收集包被magA基因的慢病毒上清并感染293T靶细胞,细胞培养基内加入500μmol/L枸橼酸铁连续4次传代,荧光显微镜观察并提取细胞行台盼蓝排除实验和普鲁士蓝染色,同时设立对照组行同样方法实验。结果酶切和DNA测序分析证实magA基因准确克隆入慢病毒表达载体设计位点,合成目的基因序列与GenBank中magA序列完全一致。荧光显微镜下观察包装细胞293FT细胞质内有大量绿色荧光表达,病毒滴度达到108 Tu/μl。慢病毒感染293T靶细胞后,细胞内稳定表达EGFP,且效率>80%。实验组及对照组台盼蓝拒染率分别为(92.80±2.65)、(93.50±1.29),2组拒染率差异无统计学意义(P>0.05)。普鲁士蓝染色发现实验组细胞内有大量蓝染铁颗粒形成,对照组呈阴性。结论 成功构建了携带磁共振报告基因magA的慢病毒表达载体,证实了magA基因在哺乳动物293T靶细胞内的转铁作用。
- 秦勇蔡金华郑鹤琳刘官信王世一刘波
- 关键词：报告基因磁共振成像慢病毒载体
