江苏省自然科学基金(BK2005428)
- 作品数：16 被引量：33H指数：3
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- 相关机构：徐州市中心医院北京大学第三医院东南大学更多>>
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- 应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)被引量：1
- 2010年
- 目的:利用Adeasy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒。方法:将人SERCA2a基因全长cDNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMVSERCA2a重组质粒,经PmeI酶切线性化,采用电击法转入到已含Adeasy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组。挑选同源重组质粒,PacI酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达。将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性。结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞。结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径。
- 吕茜魏翠张清林王洁宫海滨
- 关键词：转染
- 高血压糖尿病大鼠心脏β肾上腺素能受体及其亚型的改变
- 2009年
- 目的研究高血压糖尿病大鼠心脏β肾上腺素能受体(β-AR)及其亚型的改变。方法采用高血压糖尿病大鼠动物模型,放射配体结合实验和离体左心房收缩功能实验观察高血压糖尿病大鼠心脏β-AR及其亚型的改变。结果高血压糖尿病大鼠心脏β-AR的最大结合容量(Bmax)较对照组增加35%(P<0.01),KD值不变。CGP20712竞争抑制曲线两位点分析显示β1-AR和β2-AR之间比例未发生改变。高血压糖尿病组在异丙肾上腺素(ISO)激动下β-AR介导的最大收缩反应(Rmax)较对照组下降48%(P<0.01),而pD2值不变。CGP20712阻断β1-AR后,β2-AR介导心肌的Rmax不变,而pD2值显著低于对照组(P<0.05);ICI118551阻断β2-AR后,β1-AR介导心肌的Rmax和pD2值均显著低于对照组(P<0.05)。结论高血压糖尿病大鼠心脏β-AR总数明显上调,且β1-AR和β2-AR上调的程度相同;β-AR介导心肌最大收缩反应的降低,主要是由β1-AR的改变引起,β-AR对ISO敏感性不变,而β1-AR和β2-AR则分别发生减敏。
- 宫海滨王雷王洁张幼怡
- 关键词：高血压糖尿病Β肾上腺素能受体受体亚型心脏
- 过表达β 2-AR对心衰大鼠心肌细胞的保护作用及相关信号转导通路被引量：2
- 2010年
- 目的:检测过表达β2-AR蛋白的慢性心衰大鼠心肌细胞内与细胞存活相关蛋白的表达变化,探讨过表达的β2-AR对心衰大鼠心肌细胞的保护作用的分子信号机制。方法:通过腹主动脉缩窄术建立大鼠慢性心力衰竭(HF)模型并采用胶原酶消化法分离心衰大鼠心肌细胞,转染携带β2-AR目的基因的重组腺病毒,通过免疫印迹方法检测正常细胞和心衰细胞内Gi-PI3K-Akt信号通路上关键蛋白的表达变化。结果:与正常大鼠心肌细胞相比,β2-AR过表达促进了胞内Akt磷酸化水平的增加,而使得凋亡效应因子Caspase-3的激活减少(p<0.05)。结论:心衰大鼠心肌细胞过表达β2-AR后,增加的β2-AR通过Gi-PI3K-Akt信号对心肌细胞产生了保护作用。
- 吕茜王洁宫海滨刘颖王雷庞慧
- 关键词：Β2肾上腺素能受体基因转染
- 重组腺病毒转染心衰大鼠心肌细胞cAMP水平变化
- 2009年
- 目的测定重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染体外培养心衰大鼠心肌细胞48h后环磷酸腺苷(cAMP)的水平变化。方法重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染心衰大鼠心肌细胞,培养48h后,检测心肌细胞β2-AR蛋白表达和cAMP的水平。结果①心肌细胞β2-AR蛋白表达测定:心衰组与对照组(假手术组)相比没有明显差异(P>0.05),心衰+β2组与心衰组、对照组相比均明显升高(P<0.05)。②心肌细胞cAMP水平:心衰组与对照组(假手术组)相比明显减少(P<0.01),心衰+β2组与心衰组相比明显升高(P<0.01),心衰+ISO组与心衰组相比明显升高(P<0.01),心衰+ISO+β2组与心衰组相比明显升高(P<0.01),心衰+ISO+β2组与心衰+β2组、心衰+ISO组相比没有明显差异(P>0.05)。结论重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染体外培养心衰大鼠心肌细胞后,β2-AR蛋白表达上调,同时伴有基础cAMP逆转恢复正常水平,其可能与β2-AR活性的内在活化有关。
- 宫海滨庞慧王洁刘颖吕茜张清林魏翠
- 关键词：心力衰竭Β2-肾上腺素能受体基因转染环磷酸腺苷
- 超声对腺病毒载体在大鼠心肌内转染的影响
- 2009年
- 目的观察超声对腺病毒载体在大鼠心肌内转染的影响。方法取成年雄性SD大鼠40只,随机分为5组:心肌转染3d组、5d组、7d组、20d组和30d组,腺病毒载体转染后分别在不同时间点观察心肌转染面积。另取成年雄性SD大鼠40只,随机分为超声干预组和对照组,转染5d后取材,冰冻病理切片下测定心肌组织转染面积百分比,分离心肌细胞,测定细胞转染率。结果在心肌转染术后第5天,心肌组织转染面积最大,以后呈现逐渐下降趋势。超声干预组心肌组织转染面积百分比显著高于对照组[(9.58±2.95)%vs.(5.13±0.90)%,P<0.05],超声干预组分离心肌细胞转染率也显著高于对照组[(9.00±2.96)%vs.(5.20±1.95)%,P<0.05]。结论超声波可以提高腺病毒载体在大鼠心肌内的转染效率。
- 宫海滨王振全赵伟涛王洁
- 关键词：超声处理腺病毒科转染心肌
- β_2-AR过表达对大鼠心肌细胞存活率的影响及机制被引量：1
- 2009年
- 目的观察β2肾上腺素能受体(β2-AR)过表达对成年大鼠心肌细胞在不同浓度的异丙肾上腺素(isoproter-enol,ISO)刺激下的保护作用及机制。方法分离培养成年大鼠心肌细胞,随机分为3组:正常组、转染EGFP基因的腺病毒组和转染人β2-AR-EGFP基因的腺病毒组。心肌细胞培养48 h后,用异丙肾上腺素在不同剂量(10-6mol/L,10-5mol/L,10-4mol/L)下刺激2 h,观察细胞在刺激前后的存活率的变化。采用Western blot检测心肌细胞β2-AR的表达。结果Western blot结果显示转染β2-AR-EGFP基因的腺病毒组β2-AR蛋白的表达量明显高于其余两组(P<0.05),在10-6mol/L,10-5mol/L浓度的ISO刺激下3组细胞的存活率校正值无显著性差异,在高浓度(10-4mol/L)ISO刺激下β2-AR过表达组细胞存活率校正值明显高于其余两组(P<0.05)。结论β2-AR过表达对高浓度(10-4mol/L)ISO刺激的成年大鼠心肌细胞的死亡有保护作用,其可能的机制是通过β2-AR与Gi蛋白的耦联作用。
- 宫海滨王洁刘颖吕茜张清林
- 关键词：Β2肾上腺素能受体异丙肾上腺素心肌细胞
- 高血压病及高血压心脏病患者血浆中ox-LDL的改变被引量：11
- 2013年
- 目的评估高血压病、高血压心脏病患者血浆中氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的变化,探讨高血压病与氧化型低密度脂蛋白之间的关系。方法选择2009年10月-2010年5月徐州市中心医院门诊或心内科住院部原发性高血压患者30例和高血压心脏病患者31例,对照组为同期体检中心健康志愿者30例。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆中ox-LDL的含量。结果与对照组相比,原发性高血压组和高血压心脏病组患者血浆中ox-LDL含量均增高,差异具有统计学意义(P<0.01);原发性高血压组与高血压心脏病组患者血浆中ox-LDL含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论氧化型低密度脂蛋白的升高,从一定程度上提示ox-LDL可能与高血压病及高血压心脏病的机制有关,为进一步研究提供了依据。
- 刘颖宫海滨
- 关键词：高血压病高血压心脏病氧化型低密度脂蛋白
- 长期糖尿病大鼠心脏α_1肾上腺素能受体及其亚型的改变
- 2009年
- 目的观察长期糖尿病大鼠心脏α1肾上腺素能受体(α1-AR)及其三种亚型的改变。方法采用链脲佐菌素(STZ)注射造成胰岛素依赖性糖尿病大鼠模型,放射配体结合实验和离体左心房收缩功能实验等方法观察心脏α1-AR及其三种亚型的改变。结果糖尿病大鼠与同龄对照大鼠相比,心脏α1-AR最大结合容量(Bmax)无显著差异,但α1B-AR减少,α1D-AR增加。糖尿病大鼠左心房α1-AR介导的最大收缩反应较对照组增加36%(P<0.05),pD2值不变。α1-AR亚型三种不同选择性拮抗剂5-MU、spiperon和BMY7378拮抗NE正性变力效应的pA2值不变。结论提示长期糖尿病大鼠心脏α1-AR介导的最大收缩反应增强,其主要与受体后信号转导效应增强有关,其中以α1B-AR尤为显著。
- 宫海滨王雷王洁张幼怡
- 关键词：糖尿病Α1肾上腺素能受体受体亚型心脏
- β_2-肾上腺素能受体过表达后成年犬心肌细胞收缩功能的改变及机制被引量：2
- 2010年
- 背景:在转基因小鼠、大鼠等小动物实验中发现,心肌细胞特异性过表达β-肾上腺素受体可以改善其收缩功能,但目前尚缺乏在大型哺乳动物进行的有关实验报道。目的:探讨犬心肌细胞过表达β2-肾上腺素受体后心肌细胞收缩功能的改变及其可能机制。方法:采用胶原酶消化法分离培养犬心肌细胞,用携带β2-肾上腺素受体目的基因的重组腺病毒转染心肌细胞。转染48h后观察心肌细胞β2-肾上腺素受体蛋白表达及在基础状态和最大收缩状态下(以异丙肾上腺素10-6mol/L刺激)心肌细胞cAMP水平及收缩功能的变化。结果与结论:转染β2-肾上腺素受体的心肌细胞β2-肾上腺素受体蛋白表达及胞内cAMP水平明显增多(P<0.05),基础状态下收缩功能明显增强,但不改变最大收缩幅度百分比。说明β2-肾上腺素受体的过表达可能通过增加心肌细胞内cAMP水平改善心肌细胞的收缩功能。
- 单雨宫海滨王雷王秀力吕茜张清林刘颖王洁庞慧苏景力王振全
- 关键词：Β2-肾上腺素能受体基因转染心肌细胞
- 重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染骨髓间充质干细胞移植治疗心衰大鼠的实验研究
- 2009年
- 目的:重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)并植入心衰大鼠心肌,观察其心功能的变化。方法:采用部分缩窄腹主动脉法制备大鼠压力超负荷性慢性心力衰竭模型。分离和培养成年大鼠BMSCs,待细胞传代到第6代,用重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染BMSCs48h后将BMSCs移植入心衰大鼠心肌内。实验共分3组:心衰组、移植BMSCs组及移植转染Ad5-ADRbeta2-EGFP的BMSCs组。移植BMSCs(1×104)4周后,检测大鼠血流动力学各指标的变化。结果:荧光显微镜下可见转染BMSCs绿色荧光蛋白表达达到80%以上。移植BMSCs组和移植转染Ad5-ADRbeta2-EGFP的BMSCs组的左心室舒张末压力(LVEDP)低于心衰组,左心室内压变化最大速率(±dp/dtmax)和心率均高于心衰组,差异均有统计学意义(P<0.05)。移植转染Ad5-ADRbeta2-EGFP的BMSCs组的左心室内压上升最大速率(+dp/dt)高于移植BMSCs组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染BMSCs并移植入心衰大鼠后,能够改善心衰大鼠的心功能。
- 宫海滨王秀力李春梅张清林
- 关键词：基因转染
