国家自然科学基金(30560003)
- 作品数：7 被引量：51H指数：4
- 相关作者：冯家勋唐纪良段承杰封毅胡亚林更多>>
- 相关机构：广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室贺州学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”广西壮族自治区科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 一个新的内切葡聚糖酶基因umcel5K的克隆、表达及其表达产物的酶学特性被引量：6
- 2008年
- 从水牛瘤胃内容物的添加滤纸为碳源的富集培养物中提取未培养微生物的总DNA,以柯斯质粒为载体构建了1个含约8000个克隆的宏基因组文库,对文库进行活性筛选获得1个既表达CMCase活性又表达4-MUCase酶活性的克隆。亚克隆及测序分析发现1个潜在的可编码333个氨基酸的ORF(Open Reading Frame),其蛋白质产物与1个来源于未培养细菌的糖苷水解酶家族5的纤维素酶Cel A的同源性最高,两者的一致性为53%,相似性为68%。将PCR扩增的该基因完整的ORF克隆入表达载体pET30a(+),在大肠杆菌中得到其过量表达产物。经过Ni-NTA纯化后,该表达产物(Umcel5K)具有CMCase活性和4-MUCase酶活性,其最适pH是4.5~5.0,最适温度是50°C。pH耐受性检测表明,该酶在pH4~4.5比较稳定。温度耐受性实验表明该酶不耐高温,在55°C以下比较稳定。经过镍柱纯化的酶液比活为26.15 U/mg。部分金属离子如Fe3+、Cr2+或Cu2+会抑制该酶的酶活,而另外一些金属离子如K+、Li+等对Umcel5K的活性影响不大。
- 谭婉新刘利胡亚林段承杰唐纪良冯家勋
- 关键词：未培养微生物宏基因组文库内切葡聚糖酶克隆
- 水牛瘤胃宏基因组的一个新的β-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性被引量：32
- 2008年
- 以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库,获得1.26×10~5个克隆,文库含外源DNA的总长度约为4.8×10~6 kb。从文库中筛选到118个表达β-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的β-葡萄糖苷酶在pH5.0、37℃条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆,序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码β-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF),其编码产物的氨基酸序列与来自于Bacillus sp.的一个β-葡萄糖苷酶同源性最高,具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似,酶谱分析表明该表达产物具有β-葡萄糖苷酶活性,证实该基因为一个β-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性,其最适pH和最适温度分别为6.0～6.5和45℃。一些金属离子如Ca^(2+)、Zn^(2+)能显著提高该酶的酶活,而另外一些金属离子如Fe^(3+)、Cu^(2+)能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35℃和5 mmol/L的Ca^(2+)存在的条件下,用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg,说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。
- 郭鸿封毅莫新春段承杰唐纪良冯家勋
- 关键词：未培养微生物宏基因组Β-葡萄糖苷酶
- 堆肥宏基因组柯斯质粒文库的构建和DNA提取技术的改进被引量：1
- 2009年
- 堆肥环境中高浓度腐殖酸的存在阻碍了对这个环境中的未培养微生物的宏基因组研究。我们提出了一个确实可行的提取堆肥环境DNA的方法,这个方法通过使用Sephadex G200+酸洗PVPP层析柱与电洗脱两步纯化的方法成功地纯化堆肥环境来源的DNA,用提取的DNA成功构建了一个包含约10万个克隆的柯斯质粒文库。从这个文库中筛选到一个新的β-葡萄糖苷酶基因。针对文库低的阳性筛选率问题,利用分子技术研究了不同的分离速度对提取到的总DNA中真核生物DNA量的影响,以减少文库中真核生物DNA的污染。
- 庞浩封毅唐纪良冯家勋
- 关键词：堆肥宏基因组
- 结晶纤维素降解细菌的筛选、分离与鉴定被引量：2
- 2008年
- 采用以结晶纤维素(Avicel)为唯一碳源的平板活性筛选法,从60份森林腐殖土、腐木样品中分离得到2株在pH 5.0、37℃条件下高效降解结晶纤维素的细菌菌株GXN152和GXN153。以菌株的总DNA基因为模板,用细菌的16S rRNA基因的通用引物扩增得到菌株GXN152和GXN153的16S rRNA基因序列。测序分析表明菌株GXN152的16S rRNA基因序列和洋葱假单胞菌(Burkholderia cepacia)菌株CNR22的16S rRNA基因序列的同源性最高,具有98%的同源性,生理生化特性检测表明菌株GXN152具有洋葱假单胞菌的鉴别特征,将结晶纤维素降解菌GXN152鉴定为洋葱假单胞菌。菌株GXN153的16S rRNA基因序列和类芽孢杆菌(Paenibacillus favisporus)菌株GMP01的16S rRNA基因序列的同源性最高,具有99%的同源性,生理生化特性检测表明菌株GXN153具有类芽孢杆菌的鉴别特征,将纤维素降解菌GXN153鉴定为类芽孢杆菌。
- 陈春岚庞浩唐纪良冯家勋
- 关键词：降解细菌
- 一株降解结晶纤维素细菌的分离、筛选、鉴定及其产纤维素酶特性被引量：3
- 2008年
- 从广西5个自然保护区内采集原始森林深层腐殖土壤等样品147份,采用平板活性筛选法分离得到3500多株能降解结晶纤维素的细菌,并从中筛选到一株能在pH5.0、28℃条件下可高效降解结晶纤维素的细菌菌株N9-1-1。N9-1-1产纤维素酶水解微晶纤维素和纸浆的最适pH、最适温度分别为:4.0、40℃和4.5、35℃,但对羧甲基纤维素无水解活性。该菌株所产纤维素酶比较符合纤维素同步糖化共发酵工艺生产乙醇的要求。以菌株N9-1-1的总DNA为模板,对其16S rRNA基因进行PCR扩增和序列分析,结果表明,菌株N9-1-1的16S rRNA基因序列和粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的同源性最高,为99%。形态特征观察和生理生化检测结果表明,菌株N9-1-1具有粘质沙雷氏菌的鉴别性特征。因此,将N9-1-1鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
- 刘果张政段承杰冯家勋
- 关键词：粘质沙雷氏菌纤维素酶
- 两株纤维素降解真菌的分离鉴定及其产纤维素酶酶学性质的初步研究被引量：9
- 2008年
- 从纤维素富集的环境中采集82个落叶层下面的土壤和腐朽的树木样品，经过初筛获得大约3500株纤维素降解真菌，二次筛选后得到16株纤维素酶活性较高的真菌。以Avicel为底物，测定16株纤维素降解真菌的粗酶活性，发现真菌菌株S10和X5对Avicel有明显的活性，分别为0．119IU／mL、0．025IU／mL。通过形态学观察和rDNA的ITS（内转录间隔区）序列分析，菌株S10被鉴定为针尾曲霉（Aspergillus aculeatus），菌株X5为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。对针尾曲霉S10和草酸青霉X5的粗纤维素酶的酶学性质进行初步研究，发现粗酶活性最高的最适pH值分别为5．0、6．0，最适反应温度分别为50～60℃、45～50℃。
- 胡亚林冼亮刘果段承杰冯家勋
- 关键词：真菌纤维素酶
- 广西水牛瘤胃中的细菌多样性被引量：6
- 2009年
- 【目的】了解广西水牛瘤胃中细菌的组成及其可能的降解纤维素细菌的主要类群。【方法】提取水牛瘤胃内容物和高效降解滤纸的水牛瘤胃内容物的富集培养物的宏基因组DNA,以宏基因组DNA为模板,扩增16S rRNA基因序列,构建该两种样品的细菌的16S rRNA基因文库。通过对16S rRNA基因序列的分析,了解这两种样品的细菌群体种类及数量。【结果】水牛瘤胃内容物与其富集培养物中均主要含有LGCGPB(low G+C Gram-Positive Bacteria)、CFB(Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides)两大类菌群和少数的螺旋体菌(Spirochaetes),且LGCGPB所占的比例都是最高的,LGCGPB在水牛瘤胃内容物细菌中的比例为56.66%,而在富集培养物细菌中的比例升高为73.33%。在水牛瘤胃内容物中,丝状杆菌(Fibrobacteres)占3.33%,但在富集培养物中未被检测到。而在富集培养物中占13.33%的变形杆菌(Proteobacteria),在水牛瘤胃内容物中未被检测到。本研究还发现了分类地位尚未明确的一菌群(R46)。【结论】细菌类群LGCGPB、Proteobacteria可能在水牛瘤胃中的纤维素降解过程中起重要作用。此外,水牛瘤胃中的细菌组成和牦牛、牛、羊瘤胃中的细菌组成较相似但比例有所不同。
- 刘利唐纪良冯家勋
- 关键词：瘤胃细菌RRNA基因细菌多样性
