国家高技术研究发展计划(2006AA03Z451)
- 作品数：16 被引量：14H指数：3
- 相关作者：孟清陈格飞林瑛李佳周倩更多>>
- 相关机构：东华大学达尔豪斯大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 高剪接活性断裂蛋白质内含子的体内切割被引量：1
- 2011年
- 蛋白质内含子介导的断裂(切割)反应被用于蛋白质纯化、连接和环化等,但目前仍存在断裂效率低、断裂反应的不可控、产物复杂等问题。蛋白质内含子的定点突变可导致其N端或C端断裂。其末位氨基酸突变则剪接反应第3步天冬酰胺环化无法进行,发生N端断裂;其首位氨基酸发生突变则剪接反应第一步酰基重排及其后续步骤均无法进行,而天冬酰胺环化仍可进行,发生C端断裂。利用已获得的高剪接活性的S1和S11型断裂蛋白质内含子Ssp GyrB,分别将其参与剪接反应的首位半胱氨酸或末位天冬酰胺突变为丙氨酸,构建能够发生一端断裂的断裂蛋白质内含子。研究结果表明,突变后断裂蛋白质内含子的剪接反应几乎不发生,其断裂活性有不同程度的提高,获得了在大肠杆菌体内具有较高效断裂活性的断裂蛋白质内含子。这将为进一步研究其体外可控性剪接、构建高效的蛋白纯化系统和深入研究蛋白质内含子的剪接机制提供基础。
- 林瑛周倩荀启静孟清
- 关键词：蛋白质内含子定点突变
- 大腹圆蛛Fosmid文库的构建及MaSp基因筛选方法的探讨被引量：3
- 2010年
- 介绍了构建大腹圆蛛Fosmid基因组文库及牵引丝蛋白(MaSp)基因克隆筛选的全过程.采用改良CTAB法提取大片段基因组DNA,通过自主构建的电洗脱核酸回收装置分离回收30～40kbDNA片段,经补平磷酸化、与pCC2FOS载体连接、体外包装和转染EPI300TM-T1R,首次构建了无偏向性的大腹圆蛛Fosmid文库,其滴度为4.5×105cfu/mL,覆盖基因组倍数为10.以α-32P标记寡核苷酸探针对文库进行初步筛选,获得含MaSp基因的12个阳性克隆.该文库符合Fosmid文库的品质要求,为进一步筛选并研究大腹圆蛛MaSp基因序列奠定了基础.
- 张云龙陈格飞陈国亮林森珠张蒙恩孟清
- 关键词：大腹圆蛛FOSMID文库
- 定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3剪接活性的研究
- 2012年
- 目前,蛋白质内含子在蛋白质工程领域中得到越来越广泛的应用。为提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3(Trichodesmium erythraeum)在异源宿主中的剪接活性,采用易错PCR技术,通过改变反应体系中dNTP、Mg2+、Mn2+的浓度等手段,借助依赖卡那霉素的蛋白质内含子筛选系统进行筛选。Western印迹结果表明:通过定向进化,其中5号突变体的剪接活性从原始的约20%提高至约85%;9号突变体能够避免发生剪接副反应,即N端断裂反应。氨基酸突变位点与剪接活性变化的相关性分析表明:参与α-helix形成的氨基酸的突变极有可能影响蛋白质内含子的断裂反应,参与β-sheet形成的氨基酸的突变则有可能影响蛋白质内含子结构的紧凑性。通过定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3在异源宿主中的剪接活性,进一步验证依赖卡那霉素抗性的筛选系统的可行性,为扩大蛋白质内含子的应用范围奠定基础。
- 荀启静林瑛邱沛然孟清
- 关键词：蛋白质内含子定向进化蛋白质剪接
- 新型断裂内含肽介导的可控性C端断裂(英文)
- 2011年
- 内含肽介导的蛋白质断裂被广泛地应用于蛋白质纯化、连接和环化.但目前的方法都是用传统的连续的内含肽来介导蛋白质断裂反应,因而往往存在自发性断裂、产率低等问题.本实验选择3个S1型新型断裂内含肽Ter ThyX、Ssp GryB和Rma DnaB来实现蛋白质断裂反应的可控性.在可控性C端断裂反应中,S1型断裂内含肽的C端片段(IC)与硫氧还蛋白(T)融合作为前体蛋白,加入化学合成的Ssp DnaB S1型断裂内含肽的N端小肽与二硫苏糖醇(DTT)共同诱导C端断裂反应.结果表明,该小肽可以诱导这3个不同的S1型断裂内含肽的前体蛋白发生C端断裂反应.该方法为利用内含肽C端断裂介导的蛋白质纯化提供了更多的选择,并为内含肽的结构与功能的关系研究提供了有用的线索.
- 齐兴梅林瑛孟清
- 关键词：内含肽蛋白质剪接
- 新型T+1断裂蛋白质内含子的构建
- 2012年
- 首次从天然C端外显子为苏氨酸(Thr)的标准蛋白质内含子(TerSnf2)构建出两类T+1型断裂蛋白质内含子:Snf-S0和Snf-S1,通过蛋白印迹法测定Snf-S0和Snf-S1介导的蛋白质反式剪接效率分别达到53.5%和33.3%;当这两类断裂蛋白质内含子C端外显子分别为半胱氨酸(Cys)和丝氨酸(Ser)时均具有剪接活性.所获的两类具有剪接活性的T+1型断裂蛋白质内含子具备一定的插入位点通用性,这一特点为蛋白质反式剪接技术在蛋白质工程领域广泛应用提供了新的契机.
- 王瑾林瑛郑言成孟清
- 关键词：蛋白质反式剪接TER
- 断裂蛋白质内含子的剪接机制、起源和进化被引量：4
- 2008年
- 蛋白质内含子(intein)是具有自我催化活性的蛋白质.翻译后,通过蛋白质剪接从蛋白质前体中去掉,并以肽键连接两侧蛋白质外显子(extein)形成成熟蛋白质.断裂蛋白质内含子(splitintein)在蛋白质内含子中部区域特定位点发生断裂,形成N端片段和C端片段,分别由基因组上相距较远的两个基因编码.现在已知,它仅分布于蓝细菌和古细菌中.断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段通过非共价键(如静电作用)相互识别,重建催化活性中心,介导蛋白质反式剪接.断裂蛋白质内含子的发现进一步深化了人们对基因表达和蛋白质翻译后成熟过程复杂性的认识,而且它在蛋白质工程、蛋白质药物开发和蛋白质结构与功能研究等方面有非常广泛的应用.本文试图综述断裂蛋白质内含子的分布、结构特征和剪接机制,并分析其可能的起源和进化途径.
- 邵爱云孟清
- 关键词：蛋白质内含子蛋白质反式剪接进化
- 多种S1断裂内含肽间的体内交叉反应(英文)
- 2013年
- 断裂内含肽含有两个独立分离的多肽片段(N端内含肽和C端内含肽),它催化蛋白质反式剪接反应,在蛋白质研究与蛋白质工程中已得到诸多实际应用.在蛋白质反式剪接过程中,内含肽的N端内含肽和C端内含肽通过结构互补特异性地非共价组合.然而,Ssp DnaX S1型断裂内含肽的较大C端内含肽片段近来被发现能够与源自其它内含肽的N端内含肽片段交叉反应,表明蛋白质内含子Ssp DnaX具有结构杂交特征.本研究对另外2种S1型内含肽RmaDnaB和Ssp Gyr B的较大C端内含肽与不同S1型断裂内含肽的N-端内含肽交叉反应活性进行分析检测.目的是探讨S1型断裂内含肽的结构杂交特征是否具有普遍性.结果发现,Rma DnaB的S1C端内含肽能够与Ssp GyrB的S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1N端内含肽交叉反应;与此相似,Ssp GyrB的S1C端内含肽能够与Rma DnaB的S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1N端内含肽交叉反应.此外,某些交叉反应表现出温度依赖性.这些结果对于内含肽的结构-功能关系以及S1型断裂内含肽的应用研究具有重要的意义.
- 宋慧玲刘相钦孟清
- 关键词：蛋白质反式剪接
- 次壶腹腺丝蛋白功能模块的研究被引量：3
- 2014年
- 蜘蛛丝是天然的生物材料,具有潜在的巨大应用价值。研究蜘蛛丝蛋白质的结构与功能,有助于破解蜘蛛丝蛋白质的成丝机理,为制备优良材料学性能的仿生蜘蛛丝纤维提供理论依据。以MiSp蜘蛛丝的重复区和C端非重复区蛋白多肽为研究对象,在不同pH值和离子条件下,在体外研究其二级结构与成丝的关系。CD图谱显示:表达纯化的重组蜘蛛丝蛋白R1R2在pH 7.5、6.5和5.5时二级结构相似,均为无规则卷曲,而R1R2CT则主要呈现为α螺旋构象;扫描电镜结果表明:在以上3种pH条件下,只有pH 5.5时R1R2和R1R2CT才形成重组丝纤维,R1R2CT纤维形态较平整,类似于天然蛛丝纤维形态,而R1R2丝纤维则呈条带状,表面粗糙。另外,氯化钠不利于形成形态平整的丝纤维。该成果为研究蛛丝蛋白的成丝机理奠定基础,也为制备仿生蛛丝蛋白纤维提供理论依据。
- 贾小娜陈格飞孟清
- 关键词：Α螺旋纤维
- 应用突变的断裂蛋白质内含子标记蛋白质N端被引量：1
- 2014年
- 蛋白质的特异位点修饰可以帮助了解蛋白质的结构与功能.但是,现有的蛋白质特异位点标记方法种类有限,而且存在局限性,所以有必要开发新的蛋白质特异位点标记方法.以谷胱甘肽-S-转移酶(GST)为研究对象,借助蛋白质反式剪接技术,建立了利用新型断裂蛋白质内含子对蛋白质进行N端标记的新方法.在这个方法中,通过简单的重组表达、标记和纯化得到带有荧光基团的小肽,经过蛋白质反式剪接,荧光基团被标记到蛋白质的N端.初步研究结果显示,标记效率可达到12%.
- 戴旭东李佳刘相钦孟清
- 关键词：蛋白质剪接荧光基团
- 大腹园蛛主壶腹腺丝基因的筛选及序列分析被引量：1
- 2015年
- 为研究蛛丝蛋白编码基因和蛋白的组成结构模式、进化,并为蛛丝仿生提供更多的基因资源,运用3D/PCR(three-dimensional polymerase chain reaction)技术对大腹园蛛(A.ventricosus)Fosmid基因组文库进行主壶腹腺丝(MaSp1)编码基因的筛选,并对部分序列进行分析.通过筛选实验室前期构建的Fosmid文库获得含有MaSp1基因的阳性克隆Av11-19-5,通过shotgun测序得到MaSp1部分基因序列MaSp1RC.MaSp1RC长786bp,编码的262个氨基酸(AvMaSp1RC)可划分为保守的C端非重复区(CT)和重复区(Rep).Rep主要由poly-Ala,Glyx和GlyGlyx等模块组成,Ala和Gly含量占总氨基酸的78%;CT中参与形成离子键的氨基酸及helix 4上的疏水模块高度保守.研究结果为蛛丝蛋白二聚化及仿生学研究提供了更多的基因资源.
- 张雪陈格飞孟清
- 关键词：大腹园蛛
