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国家重点基础研究发展计划(G1999011906): 作品数：62 被引量：497H指数：17; 相关作者：陆承平才学鹏骆学农景志忠郑亚东更多>>; 相关机构：南京农业大学中国农业科学院兰州兽医研究所江苏省农业科学院更多>>; 发文基金：国家重点基础研究发展计划江苏省科技攻关计划上海市科技兴农重点攻关项目更多>>; 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>

猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用被引量：33: 2005年; 根据猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)和胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EPF)的基因序列,各设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-1的基因组为模板,扩增mrp基因1 801~2 513位序列和epf 基因1 783~2 563位序列,分别构建原核表达载体pET32a-mrp 、pET32a-epf,确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后,提取阳性克隆质粒各自进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中,重组质粒转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达分子量约为74kD的融合蛋白.用制备的两种抗血清与纯化融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白分别具有MRP与EPF的中和表位.用融合蛋白MRP-EPF免疫新西兰兔,以最小致死量猪链球菌强毒株SS2-1攻击,兔的存活率达50%(2/4),存活率明显高于单个表达产物.证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原.; 李明何孔旺陆承平; 关键词：猪链球菌2型免疫保护作用 MRP 溶菌酶释放蛋白 MRP基因 IPTG

猪带绦虫六钩蚴表膜结合蛋白45WB_2基因在毕赤酵母中的表达被引量：7: 2005年; 目的从猪带绦虫六钩蚴总RNA中扩增45WB2基因,并在甲醇酵母分泌表达载体pPIC9K中获得高效表达。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从孵化激活的六钩蚴克隆获得459bp的基因,亚克隆至酵母分泌表达载体pPIC9K中,经测序验证读码框正确后,重组质粒电转化毕赤酵母SMD1168菌株。用PCR方法检测结果表明,目的基因整合进毕赤酵母染色体DNA中。重组菌株用1%甲醇诱导,分别取诱导72和96h的上清和沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Westernblotting)分析。结果重组菌株在毕赤酵母中的表达蛋白分子量为Mr16000,表达产物占上清总蛋白量的32.8%,且能被猪囊尾蚴病患者血清识别。结论基因在毕赤酵母中成功表达,表达产物有望作为免疫原用于猪囊尾蚴病的免疫预防。; 王谨骆学农岳城胡志敏才学鹏; 关键词：猪带绦虫毕赤酵母菌

猪链球菌2型溶血素的化学修饰被引量：11: 2003年; 用DTT、H2 O2 、DEPC、EDC、N AI、NBS、PCMB、2 ,3 Diacetyl和SA等 9种化学修饰剂 ,处理猪链球菌 2型江苏分离株提纯的溶血素 ,研究其分子中氨基酸侧链基团与其溶血活性的关系。结果表明 ,巯基、氨基、羧基和酪氨酸残基等与其溶血活性无关 ,而色氨酸、组氨酸和精氨酸的化学修饰引起溶血活性的大幅度下降 ,二硫键的化学修饰引起溶血活性的大幅度增强。显示色氨酸、组氨酸和精氨酸残基是该溶血素的活性必需基团 ,二硫键的断裂可引起其活性增强。; 方绍庆陆承平; 关键词：猪链球菌溶血素化学修饰溶血活性

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡被引量：62: 2003年; 猪链球菌 2型 (SS2 )溶菌酶释放蛋白 (MRP)的致病作用迄今不明 ,为此 ,以HEp 2细胞为上皮细胞体外模型 ,将纯化的MRP溶液和细胞共孵育 ,光镜观察 ,发现MRP可诱导细胞发生两种典型形态学变化 :一是诱导细胞融合形成多核巨细胞 ,随后巨细胞发生凋亡 ;二是诱导单个细胞凋亡。透射电镜观察和流式细胞分析确证MRP具有诱导上皮细胞凋亡的功能 ,凋亡率达 1 8%。证明MRP可单独作为SS2的毒力因子。; 曾巧英陆承平; 关键词：猪链球菌溶菌酶释放蛋白细胞凋亡

猪带绦虫六钩蚴45W-4B重组蛋白的免疫原性研究被引量：15: 2006年; 目的观察猪带绦虫六钩蚴45 W-4B抗原对仔猪的免疫保护作用。方法用IPTG诱导表达融合蛋白GST-45W-4B,用GST柱进行纯化,以Montan ide ISA 206为佐剂制成疫苗免疫仔猪。间接ELISA检测仔猪血清抗45W-4B IgG抗体水平,MTT法进行外周血淋巴细胞殖试验。免疫1个月后全部实验组经口攻击感染25000枚/头猪带绦虫虫卵,攻虫3个月后剖检,计算减虫率及保护率。结果免疫组注射疫苗的第2周起,抗体为阳性,45W-4B组持续升高至第8周,淋巴细胞增殖明显高于未免疫感染组。用该抗原制备的疫苗获得了95%的减虫率和33%的保护率。结论该抗原对猪囊尾蚴病具有很好的免疫保护作用。; 王福梅骆学农景志忠岳城才学鹏; 关键词：猪带绦虫六钩蚴免疫原性

猪链球菌2型及其毒力因子检测多重PCR的建立与应用被引量：27: 2006年; 根据相关文献设计并合成引物,建立了能同时检测猪链球菌2型(cps)及其重要毒力因子溶菌酶释放蛋白(mrp)和细胞外因子(epf)的多重PCR方法。目的片段的大小分别为885bp(mrp)、675bp(cps)和443bp(epf)。对参考菌株、人工攻毒病料和临床收集病料的检测结果显示,该多重PCR特异性强、敏感性高,可直接从临床病料中检测出猪链球菌2型,并能鉴定其毒力因子表型。; 马清霞何孔旺陆承平; 关键词：猪链球菌2型毒力因子多重PCR

间接ELISA检测猪链球菌病二联灭活疫苗抗体动态变化被引量：3: 2005年; 为了评价猪链球菌病二联灭活苗的免疫效果,建立了检测该疫苗抗体的间接ELISA方法。以HRP-SPA(酶标葡萄球菌蛋白A)作为第二抗体,疫苗菌株超声波破碎抗原为包被抗原。试验证明所建立的间接ELISA特异性好,比琼扩试验敏感200倍。用此方法检测了氢氧化铝胶、蜂胶、矿物油三种佐剂疫苗的抗体消长情况,铝胶苗抗体产生的时间比较早,抗体水平比较高,4～5周达到高峰,随后开始下降,二免后抗体水平迅速回升,120d时仍保持较高的效价(1∶1000);蜂胶苗和油佐剂苗抗体上升比较舒缓,持续时间长,7周后还能维持一定的抗体水平(1∶400)。; 沈莉萍陈刚王建徐锋陆承平; 关键词：链球菌病疫苗间接ELISA方法 ELISA检测二联灭活疫苗抗体消长猪链球菌病

溶菌酶释放蛋白介导猪链球菌2型的血凝活性被引量：4: 2002年; 比较了猪链球菌 2型 (SS2 )MRP+ 菌株HA980 1和MRP-菌株 0 0 64 44的血凝特性及溶菌酶释放蛋白 (MRP)在血凝过程中的作用。 2株菌均能凝集人A、B、O型及猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠、绵羊、山羊、水牛的红细胞 ,不凝集鸡、鲫鱼、鲤鱼、金鱼的红细胞 ,且对人、猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠红细胞的凝集价极显著高于绵羊、山羊和水牛 (P <0 .0 1) ;MRP+ 菌株对人、猪、兔、BALB/c小鼠和豚鼠红细胞的凝集价均极显著高于MRP-株 (P <0 .0 1)。MRP+ 株的血凝活性对热处理极其敏感 ,且凝集速度和反应温度呈负相关。半乳糖、胰酶预处理MRP+ 株菌体能完全阻断其血凝 ,葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、过氧化氢、巯基乙醇对其则无明显影响。用纯化的MRP处理红细胞、抗MRP兔血清和MRP的单克隆抗体处理菌体 ,均能显著降低MRP+ 菌株的凝集价 (P <0 .0 5 ) ,但不能完全抑制 ;用抗MRP-菌株兔血清处理菌体 ,也能显著降低MRP+ 株凝集价。试验证明 :MRP是SS2的黏附素 ,具有半乳糖特异性受体。; 曾巧英陆承平; 关键词：溶菌酶释放蛋白链球菌2型血凝活性黏附素细胞黏附

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白的黏附作用被引量：25: 2002年; 为研究猪链球菌 2型 (SS2 )的毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)的黏附作用 ,进行了如下试验 :1 用黏附计数法比较菌株HA980 1(MRP+ )和SH0 0 6 4 4 4 (MRP-)的黏附动力学 ,两菌株均能黏附于HEp 2细胞 ,MRP+ 株的最大黏附菌数显著高于MRP+ 株 (P <0 0 5 ) 。 2 菌体置 5 6℃ 1h ,或用胰酶或半乳糖预处理 ,细菌黏附力完全丧失 ;分别用高碘酸、溶菌酶、秋水仙素和DNaseⅠ处理HEp 2细胞 ,前者可完全阻断HA980 1对它的黏附 ,后三者使黏附菌数显著下降。3 用纯化的MRP处理HEp 2细胞 ,或用抗MRP兔血清或MRP的单克隆抗体处理菌体 ,MRP+ 株的黏附菌数显著降低(P <0 0 5 ) ,但不能被完全抑制 ;用抗MRP-株全菌兔血清处理菌体 ,也能降低MRP+ 株的黏附菌数。 4 半乳糖或 5 6℃预处理MRP ,使其完全丧失对HA980 1的黏附抑制功能 ,但胰酶、过氧化氢和巯基乙醇的预处理没有明显的影响。结论 :MRP是SS2的一种黏附素。; 曾巧英陆承平; 关键词：猪链球菌2型溶菌酶

猪带绦虫六钩蚴45W-4BX的高效表达、纯化及活性分析被引量：8: 2006年; 截去猪带绦虫六钩蚴45W-4B基因的N端信号肽和C端17个疏水氨基酸序列形成45W-4BX。设计特异性表达引物,PCR扩增目的片段,经BamH和EcoR酶切后与表达载体pGEX-4T-1连接转化BL21感受态细胞。用酶切及PCR扩增鉴定阳性克隆,测序证明阅读框是否正确。用IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳,Western blot分析其活性。包涵体经纯化、透析复性后作为包被抗原检测囊虫猪和囊虫病人血清中的4B抗体。结果表明,截断的4BX(351bp)基因在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物为相对分子质量40000的融合蛋白,并能被囊虫病人血清所识别。ELISA检测表明,囊虫病人血清中含有高滴度的4B抗体,所以45W-4BX的表达产物有可能作为候选抗原用于囊虫病的诊断和免疫预防。; 骆学农郑亚东吴旭刚窦永喜景志忠才学鹏; 关键词：猪带绦虫六钩蚴活性分析

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