国家科技重大专项(2008ZX10004-007)
- 作品数：8 被引量：64H指数：5
- 相关作者：周海健朱兵清任红宇秦天邵祝军更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所中山大学南方医科大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项广东省医学科学技术研究基金广州市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 多重荧光定量PCR方法鉴定布鲁氏菌属及牛羊种布鲁氏菌研究被引量：28
- 2012年
- 目的利用多重实时荧光PCR技术,建立快速鉴定布鲁氏菌的方法。方法根据布鲁氏菌特异性基因BCSP31,AlkB/IS711和BMEI1162/IS711的部分片段作为靶基因,分别设计探针引物,将扩增产物连接到PUCm18-T载体上,制备标准品及标准曲线,确定此方法的灵敏度。利用布鲁氏菌的其他生物型菌株和同源性较近的致病菌(汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌O157∶H7、大肠杆菌O∶16、小肠结肠炎耶尔森菌O∶9、沙门氏菌N群血清型、嗜麦芽假单胞菌)验证所建立方法的特异性。通过布鲁氏菌标准菌株建立方法,优化体系后扩增97株地方株进行验证。结果应用多重Taq-Man荧光PCR技术检测布鲁氏菌结果显示,布鲁氏菌属、牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌有各自的荧光信号,而与其同源性较高的致病菌均未见荧光信号;由标准曲线可知该方法的单重和多重荧光PCR最低检测下限均约为102copy/μL(13～24fg/μL),是常规PCR灵敏度的100倍。结论建立的方法有灵敏度高、快速易操作等优点,可用于布鲁氏菌快速鉴定,并同时确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。
- 刘志国刘志国罗成旺张利姜海赵鸿雁朴东日田国忠
- 关键词：布鲁氏菌荧光定量聚合酶链式反应
- 间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定被引量：6
- 2010年
- 目的研制间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)单克隆抗体,并对抗体特性进行了初步鉴定。方法用纯化的重组PvLDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,测定其免疫球蛋白亚类及效价,结合ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果共获得5株稳定分泌抗PvLDH重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别为6D1、6D2、5A10、5C7、4A8。5株单抗培养上清的ELISA效价为1∶512～1∶1024,腹水效价为1∶12800～1∶25600,其中5C7、6D1经Western-blot鉴定能与天然的恶性疟原虫和间日疟原虫的LDH发生特异性反应。结论本研究方法成功制备并获得了针对PvLDH的单克隆抗体,为进一步研究疟疾诊断试剂奠定了基础。
- 孙莉李明吴英松周志成廖小青郝文波
- 关键词：间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体
- 间日疟原虫乳酸脱氢酶GST融合表达载体的构建及表达
- 2010年
- 目的构建间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)融合表达载体,并表达PvLDH的GST融合蛋白。方法将PvLDH基因片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建PvLDH/pGEX-4T-1融合表达载体,IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PvLDH/pGEX-4T-1融合表达系统,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物能与恶性疟原虫和间日疟原虫感染患者血清反应,而不与正常人血清反应。结论间日疟原虫LDH蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有良好的抗原性。
- 周志成孙莉吴英松廖小青郝文波
- 关键词：间日疟原虫乳酸脱氢酶
- 登革病毒TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：10
- 2012年
- 目的建立登革病毒TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床。方法根据1～4型登革病毒3'端非编码区的一段高度保守序列,设计一套型通用的引物和TaqMan MGB探针,以4个血清型登革病毒标准株为标准,以日本乙脑病毒和丙肝病毒作阴性对照,以包含登革病毒2型标准株(DENV-2NGC株)3'非编码区349bp片段的质粒DNA作标准品,对引物和TaqMan MGB探针的特异性、灵敏度进行分析,从而建立登革病毒实时荧光定量PCR检测方法。用该法对登革病毒野毒株和10份登革病毒患者血清进行检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测的1～4型登革病毒标准株及野毒株均为阳性,日本乙脑病毒和丙肝病毒均为阴性;检测灵敏度可达到每反应2个基因拷贝;检测的10份登革患者血清样本中,8份检测结果为阳性。结论 TaqMan MGB实时荧光定量PCR方法是一个快速、特异性强、敏感性高的检测登革病毒的方法,适用于登革病毒的临床早期诊断。
- 罗雅艳冯俊杰方丹云江丽芳
- 关键词：登革病毒TAQMANMGB实时定量RT-PCR
- 我国九省（市、区）82株嗜肺军团菌血清1型菌株的序列分型被引量：5
- 2011年
- 目的了解我国环境水中嗜肺军团菌血清1型（Lp1）菌株的序列分型特征，并初步建伊我国军团菌序列分型数据库。方法采用序列分型（SBT）方法，对我国9个省（市、自治区）2005--2008年问环境水中分离的82株如1菌株进行分型，同时采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型方法对这些菌株进行分型，并采用BioNumerics5．1软件对2种方法的分型结果进行聚类分析和比较。结果82株Lp1菌株分为22种序列（sT）型，其中17种ST型是新序列型，新发现1个等位基因；ST-1型为主要的序列型，在8个省（市、自治区）均有发现，该型菌株占所有菌株的46．3％（38／82）；ST．1、ST．150、ST-154、ST-159、ST-160和ST-630出现于2个以上的分离地点，5个分离位点（B4、B5、B6、S3和S8）发现2种以上ST型；通过聚类分析，15种ST型被分为3个序列群（ST-1序列群、ST-154序列群和ST-149序列群），其余7种ST型没有序列群归类。采用PFGE分型方法，这些菌株可被分为46种带型。SBT和PFGE两种方法结合可将82株菌株分为54种分子型别。两种方法的聚类分析结果具有良好的-致性。结论我国环境水中Lp1菌株具有独特的SBT分布；通过研究，初步建立了我国军团菌序列分型数据库。
- 朱兵清任红宇周海健秦天邵祝军
- 关键词：军团病杆菌嗜肺细菌分型技术电泳脉冲场
- 实时荧光PCR方法快速检测空肠弯曲菌方法的建立被引量：2
- 2009年
- 目的建立实时荧光PCR快速检测空肠弯曲菌的方法。方法以空肠弯曲杆菌HipO基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中空肠弯曲杆菌的实时荧光PCR方法;对方法的特异性和敏感性进行评价,并以正常人粪便为空白样本,添加一定量空肠弯曲菌标准株菌液进行检测,以对方法的检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法只对空肠弯曲杆菌进行特异扩增,同种属的结肠弯曲菌及其他常见食源性病原菌均不能扩增;整个检测过程只需要80min,对空肠弯曲菌菌悬液可检测至5个细菌,对加标粪便样本可检测至10～100个细菌。结论本研究建立的实时荧光PCR检测空肠弯曲菌方法不仅能实现对空弯菌的快速检测,而且还为空弯菌的快速诊断及其引起的食源性疾病的监控溯源提供有意义的参考。
- 刘俊华张欣强陈守义高秀洁李杰
- 关键词：实时荧光PCR空肠弯曲菌
- 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的建立和评价被引量：6
- 2009年
- 目的建立实时荧光PCR快速筛查耐甲氧西林葡萄球菌株和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株的方法。方法以耐甲氧西林mecA基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中耐甲氧西林葡萄球菌的实时荧光PCR方法,结合对金黄色葡萄球菌的特异性NUC基因进行实时荧光检测,可鉴定是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株。以纸片扩散法作为对照方法,对所建立的实时荧光PCR检测方法检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法的整个检测过程只需要1.5h;对22例临床样本进行检测,所建立的荧光PCR方法比纸片法多检出2例耐甲氧西林菌株;对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测结果一致。结论本研究建立的实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法不仅能实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速检测,更可能为指导临床用药提供有价值的参考。
- 高秀洁李杰刘红军
- 关键词：实时荧光PCR耐甲氧西林葡萄球菌金黄色葡萄球菌
- 中国嗜肺军团菌分离株脉冲场凝胶电泳分型分析以及数据库的建立被引量：7
- 2011年
- 目的 对分离的262株嗜肺军团菌进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析,初步建立中国嗜肺军团菌的PFGE分型数据库.方法 采用PFGE技术,对2004-2009年中国11个省（市）分离的嗜肺军团菌用AscⅠ酶切,BioNumerics软件分析PFGE图谱,并建立分子分型数据库.结果 262株嗜肺军团菌的PFGE图谱共分为108种不同的PFGE带型,相似性系数在16%～100%之间,通过聚类分析,可以分为差异明显的不同簇.不同省份、年份和血清型的菌株之间有交叉带型.结论 中国环境分离的嗜肺军团菌菌株基因组变异较大,同时也具有克隆化特征,且可能有多个克隆系存在.
- 秦天任红宇周海健朱兵清崔志刚邵祝军
- 关键词：嗜肺军团菌脉冲场凝胶电泳
