国家高技术研究发展计划(2003AA214030)
- 作品数：8 被引量：87H指数：6
- 相关作者：姚斌柏映国王亚茹罗会颖袁铁铮更多>>
- 相关机构：中国农业科学院饲料研究所中国农业科学院生物技术研究所东华理工大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国际科技合作重点项目计划国际科技合作与交流专项项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学理学更多>>
- 在烟草中表达的高比活性木聚糖酶XYNB被引量：4
- 2006年
- 来源于橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis)A1的木聚糖酶XYNB是一性质优良的高比活性木聚糖酶,已在饲料中作为添加剂应用。本研究利用携带双35S启动子和AMV增强子的表达载体,在烟草中高效表达了XYNB。转基因烟草及其子代植株基因组PCR检测证实xynB基因已整合到转基因烟草的基因组中,ELISA和SDS-PAGE以及Westernblot分析确证了xynB基因的高效表达,木聚糖酶活性分析证实了表达酶具有正常的生物学活性。表达的XYNB约占叶片总蛋白含量的6%,转基因烟草表现的最高酶活性约为170 IU/g鲜叶片(23 IU/mg总蛋白)。表达酶蛋白分子量为20.8 kD,与理论分子量相当。转基因植株可以正常生长和繁殖,T1子代植株表现了与亲代相似的酶活性,具有较好的遗传稳定性。
- 杨培龙姚斌王亚茹罗会颖袁铁铮柏映国范云六
- 关键词：转基因植物烟草
- 增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量被引量：17
- 2006年
- 为了进一步提高植酸酶的发酵效价,降低植酸酶生产成本,对毕赤酵母表达载体pGAPZα-A进行了改造。将表达载体pPIC9的AOX1启动子序列引入pGAPZα-A,使之成为甲醇可诱导型表达载体pAOXZα,插入植酸酶基因appA-m后得到重组载体pAOXZα-appA-m。以染色体上带有一个拷贝的appA-m基因、发酵效价可达到7.5×106IU/mL发酵液的重组酵母菌株74#为受体菌进行转化,在该重组菌株的染色体上的另一位点整合含有植酸酶基因的表达盒,经筛选到高表达植酸酶的重组子。通过PCR进行验证,植酸酶基因被整合到重组酵母的染色体上,且受体菌中原有的植酸酶基因结构未改变。重组菌在5L发酵罐经甲醇诱导120h植酸酶蛋白表达量达到4mg/mL发酵液,酶活性(发酵效价)达到1.2×107IU/mL发酵液以上,较含单拷贝植酸酶基因的受体菌株表达量有较大程度提高。PCR检测及表达量分析证明改良的菌株具有很好的遗传稳定性和表达稳定性。
- 罗会颖黄火清柏映国王亚茹杨培龙孟昆袁铁铮姚斌
- 关键词：植酸酶
- 一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质被引量：10
- 2007年
- 从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag+的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag+的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。
- 密士军柏映国孟昆王亚茹姚斌史秀云黄火清张宇宏石鹏君
- 关键词：丝状真菌青霉Α-半乳糖苷酶纯化酶学性质
- 弗氏链霉菌丝氨酸蛋白酶基因的克隆及表达被引量：16
- 2005年
- 从一株具有极强的降解羽毛能力的弗氏链霉菌菌株(Streptomycesfradiaevar.k11)中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2。经蛋白测序,得到部分氨基酸序列,设计简并引物,PCR扩增得到部分基因序列,通过构建基因文库,获得了包括信号肽序列在内的完整的基因sfp2(EMBL收录号AJ784940),开放阅读框全长924bp,包括114bp的信号肽编码序列和810bp的酶原编码序列,其中成熟蛋白编码基因长576bp,编码191个氨基酸,理论分子量为19.112kD。酶原编码基因和成熟蛋白编码基因均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中得到了表达,酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性,证明了克隆基因的生物学功能。
- 李江石鹏君张王照韩晓宇徐玲玲张会图姚斌范云六
- 关键词：丝氨酸蛋白酶基因克隆
- 来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达被引量：6
- 2006年
- 柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。通过PCR验证,AppA(m)已整合在酵母染色体上。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到3·2mg/mL发酵液,发酵效价达到每毫升发酵液1·4×107IU以上,高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。
- 黄火清罗会颖柏映国王亚茹姚斌孟昆袁铁铮杨培龙
- 关键词：基因改造毕赤酵母
- 弗氏柠檬酸杆菌植酸酶的分离纯化及其酶学性质研究被引量：6
- 2006年
- 从弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）中分离纯化了一种植酸酶并进行了酶学性质研究，其反应最适pH为4．0．4．5，最适温度为40℃，在37℃下以植酸钠为底物的Km值为0．85nmol/L，Vmax为0．53IU／（mg·min），具有较好的抗胰蛋白酶的能力。酶蛋白的分子量大小约为45kDa，成熟酶蛋白N端序列为QCAPEGYQLQQVLMM。
- 罗会颖石鹏君李江王亚茹姚斌黄火青袁铁铮柏映国
- 关键词：植酸酶酶学性质
- 木聚糖酶XYNB的N46D突变、表达及酶学性质变化被引量：14
- 2006年
- 对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.将突变酶XYNBN46D在毕赤酵母中表达,表达的XYNBN46D经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNBN46D的最适pH值由5·2下降到4·2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,热稳定性和最适温度也有一定的提高,但酶的比活性显著下降.结果证实,木聚糖酶XYNB的第46位Asn与其最适pH值相关.对导致酶学性质改变的可能因素进行了分析,结果为进一步的结构与功能研究提供了资料.
- 杨浩萌柏映国李江罗会颖王亚茹伍宁丰范云六姚斌
- 关键词：木聚糖酶定点突变
- 通过N端替换提高木聚糖酶的热稳定性被引量：20
- 2006年
- 以来源于Thermomonospora fusca的耐高温木聚糖酶TfxA和来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB为亲本,构建出耐热高比活融合木聚糖酶TB,将TB在大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达并对表达产物的酶学性质进行分析比较。分析表明,融合蛋白TB最适pH值为6.0,最适温度为70℃,较XYNB有大幅度的提高;在热稳定性方面,TB明显优于XYNB,将两种稀释好的酶液分别在80℃和90℃下热处理3min,TB的热稳定性较XYNB提高了6倍左右;TB的pH稳定性为5～9(相对剩余活性在50%以上的pH范围),较XYNB有所下降,但两者的比活性基本不变,保持了亲本XYNB的高比活性。通过同源建模和序列比较,分析了可能影响融合蛋白TB酶学性质的因素,为进一步研究木聚糖酶的结构与功能提供了新的思路。
- 杨浩萌孟昆罗会颖王亚茹袁铁铮柏映国姚斌范云六
- 关键词：热稳定性
