博士科研启动基金(43555026)
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
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- 重组人纤溶酶原基因的酵母表达、产物纯化及鉴定被引量：3
- 2009年
- 目的：研究重组人纤溶酶原丝氨酸蛋白酶结构域（rhPLG-SP）的酵母表达、纯化及理化性质。方法：采用7.5 L发酵罐对巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）工程菌rhPLG-SP/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达rhPLG-SP,培养液经三步纯化：超滤、Sephacryl S-100、SP-Sepharose FF,将活性组分透析后冷冻干燥。等点聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测rhPLG-SP等电点、纯度和分子量;纤维蛋白平板、肽底物S-2403分别测定rhPLG-SP激活后的纤维蛋白溶解和酰胺水解活性。结果：7.5 L高密度发酵可获得约为400mg/L培液的表达量,经三步纯化后制备的rhPLG-SP纯度大于96%。理化分析显示rhPLG-SP的等电点为7.57.8,分子量：27 877 Da,比活性：23.6U/mg。结论：初步建立了rhPLG-SP酵母工程菌的高密度培养、表达及纯化工艺,所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近,具备放大生产和应用的潜力。
- 陈武莫炜张艳玲宋钢宋后燕
- 关键词：巴斯德毕赤酵母纤溶酶原纯化
- 人纤溶酶原kringle区缺失突变体的毕赤酵母表达、产物纯化及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的研究人纤溶酶原kringle区缺失突变体（PLGAK）的毕赤酵母（Pichia pastoris）表达、产物纯化及理化性质鉴定。方法采用7．5L发酵罐对工程菌PLG△K／GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达，培液经离心、超滤、离子交换层析、凝胶滤过、透析后冷冻干燥。等电聚焦电泳、HPLC、质谱分别检测PLG△K等电点、纯度和分子量；纤维蛋白平板、肽底物S-2403分别测定PLG△K激活后的纤维蛋白和酰胺水解活性。结果7．5L高密度发酵可获得约为400mg／L培液的表达量，经三步纯化后制备的PLG△K纯度大于96％。理化分析显示PLG△K的等电点为7．5～7．8，分子量：27．787kD，比活性：23．6U／mg。结论初步建立了PLG△K的酵母高密度发酵及纯化工艺，所制备半成品活性与血浆提取的PLG相近，具备放大生产和应用的潜力。
- 陈武莫炜张艳玲宋钢宋后燕
- 关键词：毕赤酵母纤溶酶原缺失突变体纯化
- 一种含精-甘-天冬氨酰三肽人纤溶酶原K区缺失突变体在巴斯德毕赤酵母中的表达、纯化与特性被引量：2
- 2011年
- 为获得具有抗血小板聚集作用的重组人纤溶酶原(hPLG),尝试了一种含有精-甘-天冬氨酰(RGD)三肽的hPLG K区缺失突变体(RGD-hPLG-?K)。首先,从pDNR-LIB-HPLG中克隆出HPLG-?K。然后定点突变激活环内的Pro559为Asp559,形成RGD模序。构建的pPICZαA-RGD-HPLG-?K电转化巴斯德毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达后可产生0.16 g/L培液的RGD-hPLG-?K,Ni-NTA层析后纯度可达90%以上;Western blotting证实所获RGD-hPLG-?K可与兔抗hPLG抗血清反应;其24 h尿激酶激活速率和纤溶活性与hPLG-?K无显著差别(P=0.630,n=5);经尿激酶激活后,RGD-hPLG-?K的血小板聚集抑制率(21.8%±1.57%)显著高于hPLG-?K(3.8%±0.33%)(P=0.000,n=5)。表明成功构建、表达了一种具有抗血小板聚集活性的hPLG突变体,为研究新型多功能溶栓药物奠定了基础。
- 陈武吴茂材吴敬源杨健忠陈振林黄智慧张鑫涌肖郧
- 关键词：人纤溶酶原突变体抗血小板聚集巴斯德毕赤酵母
- 巴斯德毕赤酵母表达人微小纤溶酶原的放大研究
- 2011年
- 目的:研究巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人微小纤溶酶原(rh-mPlg)的放大工艺。方法:分别采用1 L摇瓶、7.5 L发酵罐对Pichia pastoris工程菌rh-MPLG/GS115进行高密度培养、甲醇诱导表达。摇瓶培液经2步纯化:SP-Seph-arose FF、Superdex 75;发酵罐培液经3步纯化:超滤、Sephacryl S-100、Q-Sepharose FF,活性组分透析后冷冻干燥。以组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)激活rh-mPlg,纤维蛋白平板测定其纤维蛋白溶解活性,计算并比较2种制备方法所获rh-mPlg比活性及得率。结果:采用1 L摇瓶和7.5 L发酵罐发酵可分别获得34 mg.L-1培液、210 mg.L-1培液的得率,经纯化后rh-mPlg纯度分别为95%和97%,比活性分别为20.6和23.0 U.mg-1。结论:以发酵罐生产rh-mPlg,可显著提高其产量,且比活性与摇瓶表达相近,验证了放大生产的可行性。
- 陈武莫炜张艳玲宋后燕
- 关键词：巴斯德毕赤酵母纤溶酶原纯化
