国家自然科学基金(30670931)
- 作品数：20 被引量：63H指数：5
- 相关作者：许峰方芳匡凤梧黄波付红敏更多>>
- 相关机构：重庆医科大学贵州省人民医院云南省第一人民医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
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- 胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及原代培养被引量：9
- 2009年
- 目的:探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell typeⅡ,AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础。方法:采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AECⅡ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(Surfactant proteinc,SPC)的表达。结果:每3～5只胎鼠可获得AECⅡ(36±5)×106,活力98%±2%。镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形。透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96%±3%,呈现SPC绿色免疫荧光的细胞占96%以上。结论:利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AECⅡ,能满足体外进一步实验的需要。
- 付红敏许峰黄波杨鸣符跃强方芳匡凤梧
- 关键词：胎鼠原代培养
- hOGG1基因高表达A549细胞株的构建及其对氧化应激的影响
- 2010年
- 目的 构建人8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶（hOGG1）基因高表达细胞株,并初步探讨该细胞株对DNA氧化损伤与修复作用的影响.方法 提取人血液淋巴细胞总RNA,设计hOGG1特异性引物,RT-PCR扩增后构建pcDNA3.1（＋）/Myc-His A/hOGG1载体.经EcoRI和KpnI酶切,凝胶电泳及DNA测序证实建立成功后,稳定转染A549细胞,Western blot法检测转染阳性细胞hOGG1蛋白表达的改变.以构建的hOGG1基因高表达细胞株为研究对象,H2O2为受试物,彗星试验检测比较各组细胞对抗损伤和修复能力的情况.结果 成功构建pcDNA3.1（＋）/Myc-His A/hOGG1质粒并转染目的 细胞,Western blot法检测转染靶细胞中hOGG1蛋白表达比空白组和阴性对照组明显增加（P〈0.05）.相同H2O2浓度下,转染细胞彗星细胞率和Olive Tail Moment明显低于空白组和阴性对照组,且修复完成率高,修复时间缩短（P〈0.05）,提示细胞对抗DNA损伤和修复能力均显著增高P〈0.05）.结论 hOGG1基因的高表达可确切减轻细胞氧化损伤敏感性并提升DNA的修复能力.hOGG1基因高表达细胞株的成功构建,为基因水平的靶向治疗研究提供了一种有效手段.
- 王昱卢仲毅许峰朱宇熹
- 关键词：真核表达载体彗星试验DNA修复
- 降钙素基因相关肽对高氧暴露下肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖及蛋白激酶Cα信号途径的调控作用被引量：3
- 2010年
- 目的探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对高氧暴露下肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）的促增殖作用及其蛋白激酶Cα／核转录因子-κB（PKca／NF—κB）信号途径的调控机制。方法将原代分离培养的孕21d胎鼠AECⅡ分为空气组、高氧组、高氧CGRP组、高氧CGRP拮抗剂组。空气组和高氧组分别在21％0z或85％。中暴露24h；高氧CGRP组在高氧处理前加入CGRP，高氧CGRP拮抗剂组同时加入CGRP和CGRP受体拮抗剂CGRP8—37。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和流式细胞术测定细胞增殖能力和不同细胞周期细胞比例；蛋白质免疫印迹法（Westernblotting）检测胞膜和胞质PKCa的表达；激光共聚焦检测NF—κBp65的细胞核表达。结果高氧组G0／G1期细胞比例明显高于空气组[（80．652±6．253）％比（45．825±2．899）％]，而细胞增殖率[（68．752±5．766）％比（100．000±6．682）％]及S期、G2／M期细胞比例[分别为（14．198±4．785）％比（27．470土2．775）％，（5．148±1．688）％比（26．708±1．863）％]均低于空气组（均P〈0．01）。CGRP干预可提高高氧暴露AECⅡ的增殖能力[（94．813±6．102）％]，使s期和G2／M期细胞增多[（30．547±9．861）％，（17．668±9．509）％，均P〈0．013。高氧组胞膜与胞质PKCa比值显著低于空气组（0．63±0．10比1．00±0．09），而NF—KBp65的荧光强度高于空气组（22．98±2．20比14．54±2．35）；高氧CGRP组胞膜与胞质PKCa比值（1．41±0．23）及核内NF—KBp65荧光强度（35．38±3．37）均高于高氧组（0．63±0．10，22．98±2．20）及高氧CGRP拮抗剂组（O．74±0．10，24．88±1．81，均P〈0．01）。结论cGRP可促进高氧暴露下AECⅡ的生长增殖；PKCα参与了CGRP对细胞作用的信号传递，而NF—κB是PKCα的下游分子之一，仅部分执行PKCα的效应。
- 付红敏李利王亚军汤春辉米弘瑛许峰匡凤梧
- 关键词：核转录因子-ΚB降钙素基因相关肽高氧
- 高氧所致氧化应激状态下肺泡上皮细胞Toll样受体的表达及其功能研究被引量：9
- 2011年
- 目的观察高氧暴露后肺泡上皮细胞内活性氧（R0s）水平与Toll样受体（TLRs）基因、蛋白表达变化及其与信号通路功能之间的关系，探讨高氧所致肺损伤炎症反应的可能机制。方法将体外培养的人肺腺癌A549细胞株分为空气对照组、高氧组、N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理组；高氧组细胞在〉90％0。的高氧环境中暴露2、6、12、24及48h，NAC预处理组细胞予以ROS清除剂NAC预处理后高氧暴露6h。于相应时间点用流式细胞术检测细胞内ROS含量以及TLR2／4蛋白在细胞中的分布和表达；用逆转录-聚合酶链反应（RT—PcR）法检测TLR2／4mRNA表达；用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞上清液中自细胞介素（IL-6、IL-8）的含量。结果A549细胞有TLR2／4表达，并且以细胞质内表达为主。与空气对照组比较，高氧组暴露2h细胞内ROS含量（荧光强度）即明显增高（11．820±3．123比7．223±1．170，P〈0．01），随高氧暴露时间延长呈进行性增高，于48h达高峰（113．837±5．247，P〈0．01）；高氧暴露2hTLR2／4mRNA表达至高峰（TLR2mRNA：1．820±0．056比1．263士0．023；TLR4mRNA：2．080±0．220比1．317±0．107，均P〈0．01），随高氧暴露时间延长，TLR2／4mRNA表达虽仍有增多，但无显著变化；高氧暴露后TLR2／4蛋白表达显著增高，6h表达至高峰（TLR2蛋白：8．370±1．548比3．930±0．277；TLR4蛋白：25．803±5．783比8．867±2．230，均P〈0．01），以细胞质内表达为主；随高氧暴露时间延长，细胞上清液中IL-6（ng／L）、IL-8（ng／L）水平呈进行性增高，于48h达高峰（IL-6：2213．41±69．99比9．76±1．47；IL-8：11520．38±429．93比159．56±20．80，均P〈0．01）。在NAC预处理情况下，高氧刺激后，细胞内ROS水平明显降低（14．050±1．257比31．180±2．336，P〈0．01），细胞TLR2／4mRNA和蛋白表达显著降低（TLR2mRNA：1．270±0．061�
- 黄栋方芳许峰
- 关键词：肺泡上皮细胞
- 神经肽P物质对高体积分数氧暴露下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞的调控作用被引量：3
- 2009年
- 目的探讨神经肽P物质(SP)在高体积分数氧(高氧)肺损伤中的调控机制及其与c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路的关系。方法分离纯化原代早产鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ),随机分为空气暴露组(空气组)、高氧暴露组(高氧组)、SP干预空气暴露组(空气加SP组)及SP干预高氧暴露组(高氧加SP组)。空气组和高氧组分别置于氧体积分数为210 mL/L和950 mL/L密闭氧仓暴露48 h;空气加SP组及高氧加SP组于暴露前加入1×10-6mol/LSP,再分别置于氧体积分数为210 mL/L和950 mL/L密闭氧仓中暴露48 h。各组分别于12、24、48 h取样,常规脱水、包埋、切片,电镜下观察AECⅡ的形态变化;3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑法及流式细胞仪测定其增殖率和凋亡率;蛋白质免疫印迹法检测磷酸化JNK的动态变化。结果与空气组比较,高氧组暴露12、24、48 h后AECⅡ增殖率均明显降低(Pa<0.05),凋亡率均明显升高(Pa<0.05),高氧加SP组AECⅡ在暴露12、24、48 h后增殖率均明显升高(Pa<0.05),凋亡率明显下降(Pa<0.05),形态学损伤明显改善。高氧刺激可导致JNK的磷酸化激活,磷酸化JNK在高氧损伤的AECⅡ表达均明显增加(Pa<0.05),SP干预后,磷酸化JNK表达明显降低(Pa<0.05)。结论SP可促进高氧暴露下AECⅡ的增殖,并通过抑制JNK信号激活从而抑制AECⅡ的凋亡,对氧化应激状态下的AECⅡ细胞有保护作用。
- 黄波李青叶梅杨海燕匡凤梧许峰
- 关键词：神经肽P物质高体积分数氧C-JUN氨基末端激酶
- 生长因子与肺发育及肺损伤被引量：1
- 2008年
- 生长因子是一类通过调控细胞增殖分化影响组织器官发育及损伤修复的多肽类物质。本文就血管内皮生长因子及血小板衍生生长因子与肺发育和高氧肺损伤的关系做一概述。
- 敖晓晓许峰
- 关键词：肺发育肺损伤
- 降钙素基因相关肽在高氧致幼年鼠肺损伤中的动态变化及意义被引量：1
- 2009年
- 目的:探讨降钙素基因相关肽(CGRP)在高氧肺损伤形成过程中的作用.方法:SD大鼠64只按随机数字表法分为8组,每组8只,分别为空气对照组和高氧暴露1 d组、3 d组、7 d组、14 d组.通过肺组织形态学及肺组织湿/干质量,了解高氧肺损伤炎症水肿的病理改变、放射免疫法检测肺组织匀浆中CGRP含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织内CGRP的两个亚型(α-CGRP,β-CGRP)的mRNA表达.结果:高氧暴露组3～7 d肺组织充血水肿,大量炎性细胞侵润;14 d肺泡腔扩大,肺纤维细胞增生;高氧暴露7～14 d组肺湿/干质量明显高于空气对照组;随高氧暴露时间延长,肺组织匀浆中CGRP浓度逐渐增高,于第3日达峰值,之后逐渐下降,第14日降至正常水平;肺组织中CGRP两个亚型mRNA表达不同,α-CGRP mRNA在高氧刺激24 h内表达开始增高,高表达持续至高氧暴露7 d,7 d后表达明显降低;β-CGRP mRNA表达晚于α-CGRP mRNA,在高氧刺激3 d时表达开始增高,高氧暴露14 d仍处于高表达状态.结论:CGRP参与高氧肺损伤的形成过程,并在减轻高氧致肺损伤方面可能起着重要的作用.
- 黄栋许峰方芳
- 关键词：高氧肺损伤降钙素基因相关肽
- 肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤修复被引量：3
- 2009年
- 长期吸入高浓度氧可致肺氧化性损伤，是引起早产儿支气管肺发育不良的主要原因之一。正常肺泡上皮的修复增生有赖于肺泡Ⅱ型上皮细胞的增殖和分化。高氧肺损伤治疗的根本难题在于内源性肺泡上皮不能恢复，肺组织修复过程中不能由正常的肺泡上皮替代，而是由成纤维细胞替代。该文就肺表面活性物质、干细胞、细胞因子与肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤修复的关系作一综述。
- 冉迎春许峰
- 关键词：上皮细胞支气管肺发育不良肺表面活性剂干细胞细胞因子类
- Toll样受体2基因小干扰RNA对高氧所致氧化应激状态下肺泡上皮细胞功能的影响被引量：1
- 2014年
- 目的探讨Toll样受体2（TLR2）基因小干扰RNA（siRNA）对体外高氧暴露条件下A549细胞TLR2基因、蛋白表达及其下游信号通路功能的影响。方法肺泡上皮细胞株A549置于6孔培养板培养，完全随机分为4组：N组（正常培养组）、H组（高氧组）、T组（高氧±TLR2-siRNA转染组，转染化学合成TLR2-siRNA）和C组（高氧±阴性对照siRNA转染组，转染化学合成含对照序列的阴性对照-siRNA）。运用脂质体转染技术介导化学合成siRNA转染，其中H组、T组和C组细胞高氧培养6h后，流式细胞术检测转染后A549细胞5．羧基荧光素双醋酸盐的表达率，实时定量荧光聚合酶链反应方法检测各组A549细胞TLR2mRNA的表达水平，流式细胞术方法检测各组A549细胞TLR2蛋白表达变化，凝胶电泳迁移率实验检测各组细胞核因子KB核转录水平，酶联免疫吸附测定方法检测各组上清液中白细胞介素6（IL-6）和IL-8含量。结果转染后A549细胞5-羧基荧光素双醋酸盐的表达率为（92．3±9．6）％；经高氧处理后，H组和C组的TLR2mRNA、TLR2蛋白水平、核因子KB核转录水平较N组均明显上调[（1．68±0．02）、（1．52±0．06）比（1．26±0．02），（9．1±0．8）、（7．8±1．4）比（5．9±2．8），（484±64）、（378±38）比（46±3）]（P〈0．05），各组上清液IL-6、IL-8含量较N组也明显升高（P〈0．05）；而T组TLR2mRNA表达（0．87±0．06）、TLR2蛋白表达（2．8±0．4）、核因子KB核转录水平（228±29）和上清液IL-6、IL-8含量较H组和C组均明显下调[IL-6：（48．5±6．3）ng／L比（66．7±7．8）、（59．6±6．5）ng／L，IL-8：（125±19）ng／L比（773±96）、（971±149）ng／L]（均P〈0．05）；T组与N组相比，各项检测指标表达差异也有统计学意义（P〈0．05）。结论针对TLR2mRNA的小干扰RNA可以部分抑制高氧诱导的A549细胞的炎症反应，但是并不能完全阻断核
- 黄栋方芳许峰
- 关键词：小干扰RNA高氧TOLL样受体2肺泡上皮细胞
- 神经肽P物质对早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的调控作用被引量：1
- 2010年
- 目的探讨高氧对离体培养的早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)的影响及感觉神经肽P物质(SP)的保护作用及其与p38蛋白激酶(p38MAPK)信号转导机制的关系。方法分离纯化原代早产鼠AECⅡ,随机分为空气暴露组、高氧暴露组、SP干预空气暴露组及SP干预高氧暴露组。空气暴露组氧体积分数为0.21(21%),高氧暴露组氧体积分数为0.95(95%),SP干预组于暴露前加入SP1×10-6mol/L,在置于氧体积分数为0.21(21%)和0.95(95%)中各组分别暴露12、24、和48h,电镜观察AECⅡ的形态变化;MTT法及流式细胞仪测定其增殖率和凋亡率;蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测磷酸p38MAPK的动态变化。结果与空气暴露组比较,高氧组暴露12、24、48h后AECⅡ增殖率明显降低,凋亡率明显增加,而SP干预后其增殖率明显增加,凋亡率明显下降,形态学的损伤也有明显的改善。高氧刺激可导致p38的磷酸化激活,磷酸化p38在高氧损伤的AECⅡ表达明显增加,SP干预后,磷酸化p38表达明显降低。结论 P物质可促进高氧暴露AECⅡ的增殖并抑制AECⅡ的凋亡,SP通过抑制p38MAPK信号激活对氧化应激状态下的AECⅡ细胞可起到保护作用。
- 黄波李青匡凤梧许峰
- 关键词：高氧P38蛋白激酶
