广东省自然科学基金(05004735)
- 作品数：7 被引量：10H指数：2
- 相关作者：杨晓强陈学清姜泊赵亚刚武金宝更多>>
- 相关机构：南方医科大学南方医院广州军区广州总医院广州医学院第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金广东省教育部产学研结合项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达被引量：1
- 2011年
- 目的构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法将采用基因拼接方法获得的TETC基因从测序正确的质粒pBS-TETC上以SalⅠ、HindⅢ切下,分别定向连接到以XhoⅠ、HindⅢ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBC1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBC2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western blot检测蛋白定位表达情况。结果构建了分泌表达及锚定表达TETC的乳链菌表达载体pNBCL1002与pNBCL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETC的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETC大小约为57.8 kD,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETC大小约为73.5 kD的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%、膜蛋白的17.9%;Western blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论成功构建了TETC乳链菌表达载体并在乳链菌内表达TETC,初步验证了表达的TETC的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定基础。
- 杨晓强赵亚刚孙大勇姜泊陈学清
- 关键词：疫苗
- 体外拼接破伤风毒素C片段基因被引量：3
- 2008年
- 目的以破伤风毒素C片段(TETC)基因为例,探讨区段基因拼接方法。方法根据已知的TETC基因序列(GenBank登记号M12739,367-1719),结合乳链菌氨基酸密码子的基因编码情况,设计适于在乳链菌内表达的TETC基因序列,为进一步克隆,根据同义突变的原理消除序列中的EcoRI和KpnI的酶切位点,在TETC基因的5′端加上SalI酶切位点,3′端加上XhoI和HindⅢ酶切位点,序列全长1383bp。将其中1380bp的片段使用DNAstar6.0设计为68条长40bp的寡核苷酸TETC_1-TETC_68,设计TETC_69作为下游引物。分3个区段分别拼接TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,随后分别以TETC_1、TETC_69为上下游引物,进行TETC全长基因的拼接,将获得的TETC基因经SalI和HindⅢ双酶切后连接到经相同双酶切的p BluescriptⅡSK(+),得到的阳性克隆经测序鉴定。结果分别拼接出大小约500bp的TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,等浓度的3个区段混合后,拼接出了全长为1383bpTETC基因,目的基因连接到载体后测序与设计的TETC基因完全一致。结论区段基因拼接法采用分段拼接的方法先拼接出全长基因的组成部分,随后进行全长基因拼接,更适合长基因片段的体外拼接。
- 杨晓强武金宝姜泊赵亚刚陈学清
- 关键词：破伤风毒素
- 重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证被引量：1
- 2008年
- 目的运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌,并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株。方法将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达。结果获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实,酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF。结论运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床应用价值打下了基础。
- 马高峰陈学清杨晓强武金宝张振书
- 关键词：粒-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌基因克隆重组质粒蛋白表达
- 艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达
- 2006年
- 目的:克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区(CDTAR)基因.方法:PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET-22b(+),重组质粒转化到E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对表达产物进行分析.结果:构建了含CDTAR基因的重组质粒pET-CDTAR,IPTG诱导后SDS-PAGE显示表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的36.1%,可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%.结论:成功克隆了CDTAR基因,并构建表达了CDTAR重组蛋白,为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.
- 杨晓强王亚东孙勇陈学清姜泊
- 关键词：艰难梭菌基因表达
- 乳链菌表达系统的构建及其鉴定被引量：6
- 2005年
- 目的构建可以在乳链菌表达外源性基因的系统。方法采用基因拼接方法拼装含有P59启动子、USP45蛋白信号肽及多克隆位点的基因序列,并将其连入质粒pBluescriptIISK(+)以形成重组质粒pBS-PU,PCR扩增USP45终止子并连接至质粒pBS-PU构建可将外源性基因分泌表达于菌体外的质粒pNBC1000,PCR扩增M6基因随后连接至pNBC1000构建可将外源性基因分泌表达于菌体外及锚定表达于细胞壁的质粒pNBC2000。通过将增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因连接至质粒pNBC2000,激光共聚焦显微镜下观察含有pNBC2000-EGFP质粒及对照质粒的细菌,验证EGFP定位表达情况。结果所构建的表达系统可以表达EGFP基因。结论通过基因拼接方法成功构建了乳链菌表达系统,其可将外源性基因分泌表达于菌体外。
- 杨晓强彭春秀姜泊邢锐张绍荣陈学清
- 关键词：基因拼接外源性基因
