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蓝氏贾第鞭毛虫PPDK多肽抗体制备与定位研究被引量：2: 2015年; 目的制备蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)磷酸烯醇式丙酮酸双激酶(PPDK)特异性多肽抗体并进行PPDK定位。方法采用DNAstar软件和BIOSUN生物医学软件,结合抗原表位分析的基本原理,对贾第虫PPDK的氨基酸序列进行抗原分析,最终确定贾第虫PPDK的优势抗原表位肽。将上述抗原表位肽与KLH进行偶联,获得3个偶联蛋白,经脱盐柱吸附、洗脱纯化后,对抗原表位肽-KLH偶联蛋白进行定量测定。将得到的3条多肽-KLH偶联物混合,用PBS稀释为1mg/ml,分别与第1、15、29和43d免疫4只新西兰白兔[于颈背部皮下多点(至少8点)注射多肽抗原2mg],获得抗PPDK抗血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot试验检测抗体的滴度和特异性。以R3为一抗,以DyLight 649抗兔IgG为二抗,采用免疫荧光法进行PPDK的细胞定位。结果根据PPDK抗原分析结果,最终确定PPDK的优势抗原表位3个,即p1:TPENQPANSELC(氨基酸位点12-23),p2:KTRYGRKTDPELC(氨基酸位点167-178)和p3:DLQKKLAEDMNKKHC(氨基酸位点641-654)。与KLH偶联获得3个多肽偶联蛋白,即P1、P2和P3。3个偶联蛋白联合免疫新西兰白兔获得4份抗PPDK抗血清,纯化后的抗体分别命名为R1、R2、R3和R4。Western blot检测显示,R3和R4可与PPDK特异性结合,无交叉反应。以R3为一抗进行免疫荧光试验,结果显示PPDK主要定位于贾第虫细胞的胞浆内。结论本研究获得2个可与贾第虫PPDK特异性结合的抗体,并初步判断PPDK主要分布于贾第虫细胞胞浆,为PPDK功能研究奠定了基础。; 冯宪敏张宏梅李瑶鞠晓红卢思奇; 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫多肽抗体

苯磺酸氨氯地平乳剂凝胶的制备及其体外透皮吸收的考察被引量：9: 2016年; 目的:制备苯磺酸氨氯地平乳剂凝胶,考察不同透皮吸收促进剂对其体外透皮吸收的影响。方法:选择4种不同基质制备苯磺酸氨氯地平乳剂凝胶,优化处方;采用立式改良Franz扩散池,优选接受介质,研究卵磷脂、萜烯类化合物、氮酮3类促进剂对苯磺酸氨氯地平乳剂凝胶体外小鼠模型透皮释放的影响。结果:最佳凝胶基质为25%泊洛沙姆F127,最佳透皮吸收促进剂为2.5%卵磷脂,苯磺酸氨氯地平乳剂凝胶的累积渗透量Q24h达到(148.69±39.92)μg·cm-2,JS为(6.19±1.66)μg·cm-2·h-1。结论:2.5%卵磷脂作为苯磺酸氨氯地平乳剂凝胶渗透效果良好,为今后开发经皮给药制剂提供理论基础。; 张宏梅崔佰吉钱曦垚范红艳冯宪敏; 关键词：苯磺酸氨氯地平经皮渗透

棘阿米巴原虫全长cDNA文库的构建被引量：4: 2014年; 目的快速构建棘阿米巴滋养体全长cDNA文库，为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定基础。方法以棘阿米巴滋养体分离株，ed,RNA为模板，以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物逆转录合成单链cDNA，采用长距PCR（10ng—DistancePCR，LDPCR）方法扩增得到双链cDNA，经蛋白酶K消化和sfiI酶切后通过色谱柱CHROMASPON-400按分子质量进行分离，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收纯化0．4～2．5kb分离产物。取1μlPCR产物与λ噬菌体连接，以XL1-BLUE为受体菌扩增得到cDNA文库，分别用梯度法和随机测序法检测文库滴度与重组率。结果成功构建棘阿米巴cDNA文库，文库滴度为3．85×10^7pfu／ml，插入片段大小在0．4～2．5kb之间．重组率为100％（20／20）。结论棘阿米巴滋养cDNA文库构建成功，为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定了基础。; 王月华冯宪敏李瑶鞠晓红孙艳美; 关键词：棘阿米巴 CDNA文库

蓝氏贾第鞭毛虫表面变异抗原反义mRNA的鉴定: 2014年; 目的鉴定编码蓝氏贾第鞭毛虫（简称贾第虫）表面变异抗原（VSP）的正义和反义mRNA。方法采用Trizol法抽提贾第虫单克隆滋养体总RNA,SMART法逆转录合成cDNA。设计合成针对VSPs基因3′端保守区域的特异性引物（内、外引物各1条）,结合SMART引物采用巢式PCR分别扩增得到来源于正义和反义mRNA的cDNA片段。将PCR产物与pGEM-T载体连接并测序,测序结果与GenBank库中的已知序列进行比对。根据测序结果设计特异性引物,以巢式PCR产物为模板,进行正义和反义cDNA的检测。结果巢式PCR显示,VSP正义mRNA和反义mRNA的cDNA均被成功扩增,电泳鉴定扩到产物分别位于0.1~4kb和0.2~2kb。经克隆、测序和序列比对,共获得34个贾第虫VSP编码序列,其中5个来源于正义mRNA的扩增产物,29个来源于反义mRNA的扩增产物,所得VSP编码基因均含有贾第虫VSP mRNA N端变异区和C端特异性保守区。根据5个正义mRNA序列设计的特异性引物在正义mRNA均得到扩增产物,而在反义mRNA仅有4个得到扩增产物。从29个反义mRNA序列中挑选3个设计特异性引物进行PCR,正义mRNA和反义mRNA均得到扩增产物。结论贾第虫VSP基因转录的多个正义mRNA和反义mRNA序列同时存在,该基因存在转录后基因沉默调节机制。; 郑文彧冯宪敏鞠晓红李瑶王月华; 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫

Current advances in diagnostic methods of Acanthamoeba keratitis被引量：2: 2014年; Objective The objective of this article was to review the current advances in diagnostic methods for Acanthamoeba keratitis （AK）.Data sources Data used in this review were retrieved from PubMed （1970-2013）.The terms ＂Acanthamoeba keratitis＂ and ＂diagnosis＂ were used for the literature search.Study selection Data from published articles regarding AK and diagnosis in clinical trials were identified and reviewed.Results The diagnostic methods for the eight species implicated in AK were reviewed.Among all diagnostic procedures,corneal scraping and smear examination was an essential diagnostic method.Polymerase chain reaction was the most sensitive and accurate detection method.Culturing of Acanthamoeba was a reliable method for final diagnosis of AK.Confocal microscopy to detect Acanthamoeba was also effective,without any invasive procedure,and was helpful in the early diagnosis of AK.Conclusion Clinically,conjunction of various diagnostic methods to diagnose AK was necessary.; Wang YuehuaFeng XianminJiang Linzhe; 关键词：BLINDNESS

兔棘阿米巴角膜炎模型血清抗体效价分析被引量：2: 2014年; 10只健康新西兰白兔随机分为实验组(n=8)和阴性对照组(n=2)。实验组兔左眼为实验眼,右眼为空白对照眼。实验组采用氢化可的松点眼3 d后行角膜基质内注入赫氏棘阿米巴滋养体和包囊悬液(1×106/ml)0.2 ml。对照组兔角膜基质内注射等量生理盐水。于注射后每天记录兔眼角膜病变情况,刮取角膜组织进行病原学检测。于感染后不同时间采血和摘取角膜进行抗体效价检测和病理学检查。经角膜刮片镜检和角膜病理切片HE染色观察证实,实验眼感染棘阿米巴,并出现棘阿米巴角膜炎典型表现和病理改变。血清抗体效价随感染时间的延长而升高,于感染后第28天达峰值(A450值为2.2358),而后逐渐下降,并维持稳定,直到处死仍高于阴性对照组。阴性对照组血清抗体效价无明显变化。; 王月华郑文彧赵丽薇冯宪敏李瑶鞠晓红; 关键词：棘阿米巴角膜炎动物模型抗体

棘阿米巴原虫actin1基因原核表达载体构建与鉴定: 棘阿米巴角膜炎的临床诊断比较困难,以角膜刮片的病原学诊断为主,样本的采集困难,临床诊断率低。本研究构建了棘阿米巴原虫actin1基因进行原核表达载体,并进行鉴定。以棘阿米巴滋养体cDNA为模板,通过特异性引物,经聚合酶链...; 孙宏宇杨春梅王双露李金旺冯宪敏; 关键词：棘阿米巴原核表达; 文献传递

棘阿米巴原虫actin1基因原核表达载体构建与鉴定被引量：1: 2018年; 棘阿米巴角膜炎的临床诊断比较困难,以角膜刮片的病原学诊断为主,样本采集困难,临床诊断率低。本研究构建了棘阿米巴原虫actin1基因进行原核表达载体,并进行鉴定。以棘阿米巴滋养体cDNA为模板,通过特异性引物,经聚合酶链反应,获得actin1基因开放阅读框（ORF）片段,进行克隆及序列分析,经双酶切,连接,构建重组表达载体pET22b（＋）-actin1。将重组载体转化入大肠杆菌（E.coli）DH5α,筛选出阳性菌落,经PCR扩增和酶切鉴定后,阳性质粒送样测序;提取阳性质粒,转化入E.coli BL21（DE＋）,1mol/L IPTG诱导重组蛋白r-actin1的表达。自棘阿米巴滋养体cDNA扩增得到约774bp的actin1基因片段;经PCR和酶切鉴定表明,重组表达载体pET22b（＋）-actin1构建成功;重组菌株BL21（DE＋）/pET22b（＋）-actin1,经培养、诱导、SDS-PAGE电泳,出现1条相对分子质量约为30 000重组蛋白条带,r-actin1表达诱导表达成功。成功构建重组表达载体pET22b（＋）-actin1,并诱导表达。; 李垚艳梁宸杨春梅王双露李金旺冯宪敏; 关键词：棘阿米巴原核表达

棘阿米巴角膜炎模型和实验室诊断研究进展被引量：1: 2015年; 棘阿米巴原虫是一种机会致病自由生原生生物,主要引起人类两种疾病,即棘阿米巴脑炎和棘阿米巴角膜炎。本文综述了阿米巴角膜炎实验室诊断的研究进展。; 冯宪敏王月华; 关键词：棘阿米巴原虫棘阿米巴角膜炎动物模型

减毒沙门菌携带CWP2-S基因抗贾第虫口服疫苗的免疫原性: 2015年; 构建重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S,对其免疫效果进行检测。酶切连接法构建重组质粒p VAX1-CWP2-S,以电击转染的方式转入减毒沙门菌SL7207。体外连续培养检测重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S对质粒p VAX1-CWP2-S的携带稳定性;以重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1作为对照,经口服喂饲的方式免疫清洁级雌性BALB/c小鼠,8周后处死,检测各组试验鼠血清中和小肠灌洗液中特异性Ig G和SIg A的水平。结果是重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S连续培养168 h后,质粒携带率为90%;口服免疫小鼠8周后,与对照组相比,重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S免疫组血清特异性Ig G抗体增高约4.4倍,小肠灌洗液中特异性SIg A抗体增高约6.67倍。表明重组CWP2-S减毒沙门菌株具有良好的免疫原性。; 张宏梅郑文彧李瑶姜晓明冯宪敏; 关键词：蓝氏贾第鞭毛虫减毒沙门菌口服疫苗

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