上海市科学技术委员会资助项目(04DZ19505)
- 作品数：4 被引量：7H指数：2
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- 发文基金：上海市科学技术委员会资助项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 携带可调控人胰岛素基因的腺病毒载体的构建和鉴定
- 2006年
- 目的:构建携带葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)启动子控制下的人胰岛素基因的腺病毒载体。方法:将GIP- hIns基因自pCDNA3-GIP-hIns质粒中酶切下来,克隆至切除CMV启动子的pCA13-△CMV质粒中,形成转移质粒 pCA13-GIP-hIns,然后与质粒pBHGE3共转染至293细胞株,在其中同源重组形成腺病毒颗粒。采用PCR方法对重组体进行鉴定,同时测定病毒滴度。体外转染STC-1细胞,并采用RT-PCR检测感染腺病毒的细胞内有无hIns mRNA 的转录。结果:由pCA13-GIP-hIns和pBHGD共转染至293细胞后,可得到阳性重组体Ad.GIP-hIns,经PCR检测表明已含有GIP-hIns基因。纯化所得腺病毒滴度约为1×1011 pfu／ml。RT—PCR证实在感染重组体腺病毒Ad．GIP— hIns的细胞中有相应mRNA的转录。结论:成功构建了携带GIP启动子控制下的人胰岛素基因的腺病毒载体,为进一步胰岛素基因治疗糖尿病的实验研究奠定了基础。
- 徐美东张轶群沈坤堂姚礼庆秦新裕
- 关键词：腺病毒载体人胰岛素基因
- 特异性转录因子在正常小鼠和糖尿病小鼠胰岛内的表达及其意义
- 2008年
- 目的探讨正常小鼠与糖尿病小鼠胰腺组织病理学特征的异同及其意义。方法正常C57BL／6小鼠作为对照组（n=4），腹腔内注射链脲霉素（STZ）的C57BL／6小鼠作为STZ组（n=8），非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠作为NOD组（n=2）。观察各组小鼠胰腺组织苏木素-伊红（HE）染色特点；应用免疫荧光技术观察特异性标记物在各组小鼠胰腺组织中的表达情况。结果STZ、NOD组小鼠与对照组小鼠比较，HE染色：胰岛数目明显减少；免疫荧光染色：胰岛中Insulin^＋细胞与Glucagon^＋细胞数量比例倒置，Nkx2．2和Nkx6．1的表达均减少，STZ组小鼠胰岛中有少量Ngn3^＋细胞及Insulin^＋Glucagon^＋细胞。结论糖尿病小鼠血糖升高可能是由于B细胞和仅细胞数量的比例倒置所致；成体小鼠胰腺中有干细胞样特性的细胞存在；Nkx2．2需要其他转录因子的参与才能使胰岛内分泌前体细胞生成成熟B细胞。
- 宋陆军沈睿高晓东王洪山牛伟新秦新裕
- 关键词：糖尿病胰岛干细胞
- 小鼠肝星状细胞分离纯化和体外培养模型的建立被引量：6
- 2011年
- 目的 建立小鼠肝星状细胞（m-HSCs）分离纯化的高效稳定方案,并通过原代和传代培养观察其生物学特性.方法 依次应用预灌注液、0.1% Pronase E、0.075% Collagenase NB4G对在体肝脏原位灌注消化.肝脏离体后,在0.02%DNaseI液中磁力搅拌消化10 min,低速离心（25g,5 min）去除残余肝实质细胞,进一步用Optiprep密度梯度液获得纯化的m-HSCs.采用锥虫蓝染色法评估细胞产量及活力;采用自发荧光及油红O染色鉴定细胞纯度;采用光镜、电镜以及Desmin/α-SMA免疫荧光双染色观察细胞形态和生物学特征.结果 分离得到的原代m-HSCs数量为（1.4±0.3）×106/g肝脏,细胞活率＞95%;原代培养24 b后,细胞纯度＞90%,传1代后细胞纯度接近100%.静止期和不同活化阶段的m-HSCs在亚显微结构以及α-SMA表达强度等方面存在差异.结论 建立的m-HSCs分离和纯化方法及体外细胞培养模型具有稳定性和高纯度性及高活率性.
- 常文举宋陆军王洪山高晓东牛伟新秦新裕
- 关键词：肝星状细胞
- 小鼠成体肝脏干细胞体外培养模型的建立被引量：2
- 2008年
- 目的观察正常成体小鼠肝细胞的增殖能力和分化潜能，分离成体小鼠肝脏内可能存在的干细胞或祖细胞，建立细胞培养模型。方法应用改良的Seglen二步法灌注和离心分离肝脏细胞，用含血清的改良DMEM培养基进行培养，持续观察超过60d。应用免疫荧光技术对肝细胞及其形成的克隆进行Albumin、AFP和CK19染色。结果部分肝脏细胞培养第2～3天后活化，迅速增殖并形成细胞克隆，培养30d后克隆内出现类似成熟的肝细胞，细胞克隆持续扩增超过60d。该类细胞培养第1天强阳性表达肝细胞标记物Albumin，培养第5天细胞克隆开始表达肝脏干细胞标记物AFP，第55天表达胆管细胞标记物CK19。结论在成体小鼠未损伤肝脏内存在一种成体肝脏祖细胞（adult hepatic progenitor cells，AHPCs），该细胞体外培养具有较强的增殖能力，可分化为肝细胞和胆管细胞，并成功建立了AHPCs的体外培养模型。
- 王洪山宋陆军沈坤堂刘隽高晓东沈睿牛伟新秦新裕
- 关键词：肝细胞移植肝脏干细胞细胞培养
