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2型猪链球菌MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除突变体的构建及毒力分析被引量：2: 2015年; 目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33中MocR家族转录调控因子SSU0562基因敲除的突变株,探索SSU0562基因缺失对细菌基本生物学特性和毒力的影响。方法:构建左右两侧为SSU0562基因上下游的同源序列,中间部分为壮观霉素抗性基因(Spcr)的基因敲除质粒,通过同源重组的方法筛选SSU0562基因敲除突变株Δ0562。对突变株与野生株的基本生物学特性进行系统的比较分析,并且将小鼠作为动物感染的模型来研究突变株的毒力。结果:组合PCR的分析及基因测序结果均表明Spcr完全取代了S.suis2中SSU0562基因位点,表明基因敲除突变体Δ0562构建成功,反转录PCR(RT-PCR)证实了突变株Δ0562中SSU0562基因在转录水平的缺失;在溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力方面,突变株Δ0562与野生株05ZYH33相比均无显著差别,然而革兰染色实验显示突变株Δ0562的成链能力明显减弱。结论:猪链球菌强毒株05ZYH33的毒力并未因SSU0562基因的缺失而发生显著性改变,表明SSU0562基因并非猪链球菌的毒力决定因子,但很有可能参与猪链球菌成链能力的调控。; 李娟刘丽娜胡丹朱旭辉龚秀芳赵琳钟璟皓潘秀珍王长军; 关键词：2型猪链球菌

链球菌组氨酸三聚体家族蛋白的研究进展被引量：1: 2014年; 组氨酸三聚体家族蛋白Htp是一类广泛分布于链球菌属的细菌表面蛋白,其氨基酸序列的典型特征是存在多个重复出现且高度保守的组氨酸三聚体基序His-x-x-His-x-His。该家族蛋白在细菌的生理和致病过程中发挥重要功能。本文简要综述了该家族蛋白的发现、结构特征、分类、在细菌致病过程中的作用及其作为潜在的蛋白疫苗侯选分子的最新研究进展。; 李敏高基民潘秀珍

2型猪链球菌AdcR蛋白的原核表达被引量：2: 2015年; 目的表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)调控因子AdcR蛋白,为研究其在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白的作用机制奠定基础。方法通过与相关家族蛋白进行同源性比较,在2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找出编码AdcR的基因。以AdcR基因序列为基础,利用Primer5.0设计引物,采用PCR扩增AdcR基因,经BamHⅠ和HindIII双酶切后将目的片段通过T4DNA连接酶连接至表达载体pET32a,转化大肠埃希菌E.coli BL21,加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L,37℃诱导4h表达AdcR蛋白,然后利用His亲和层析柱纯化AdcR蛋白。结果通过Blast分析,从2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找到编码AdcR的编码基因05SSU0109。以合成的特异引物PCR扩增出469bp的AdcR片段,连接原核表达载体pET32a后转化E.coli,经IPTG 37℃诱导4h,成功表达出AdcR蛋白,其分子质量单位为40ku,与理论值相符。经His-Tag亲和层析纯化,获得较高纯度的重组AdcR蛋白。结论在大肠埃希菌中成功表达了可溶性的AdcR重组蛋白,为AdcR在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白作用机制研究奠定了基础。; 王玲倪华邵珠卿侯田青过雨晴杜世仁胡丹王长军潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌克隆

真核样丝氨酸/苏氨酸激酶在链球菌中的研究进展被引量：4: 2014年; 有机体的生存需要不断应对变化的环境。信号转导系统的存在有助于生物对不同的内外界信号做出相应的回应。蛋白质的磷酸化是信号转导的重要机制,二元信号转导系统(two-component signal transduction system,TCSTS)是细菌最普遍的信号转导方式,然而最早在真核生物中发现的丝氨酸、苏氨酸的磷酸化在原核生物中已成为研究的热点。丝氨酸/苏氨酸激酶与磷酸酶的协同作用与致病菌各种生命活动息息相关,包括生长,代谢,毒力以及应激压力等。本文重点介绍几种常见的链球菌中的丝/苏氨酸激酶,了解其在致病菌中的作用。鉴于真核生物STK已有大量的抑制剂被广泛使用,对链球菌真核样丝/苏氨酸激酶STK(eukaryotic-like Ser/Thr kinase,eSTK)的深入了解将有助于寻找应对链球菌感染的预防和治疗手段。; 杜骁杰潘秀珍; 关键词：磷酸化链球菌苏氨酸激酶

猪链球菌cAMP结合蛋白基因敲除株的构建及生物学特性: 2015年; 目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33 c AMP结合蛋白(CRP)编码基因敲除突变株及基因回复互补株,并探究CRP基因的缺失对细菌生物学特性及毒力的影响。方法:构建中间为壮观霉素抗性基因(Spcr)、两侧为CRP编码基因上下游同源序列的基因敲除质粒,通过同源重组筛选CRP编码基因敲除突变株ΔCRP;构建CRP编码基因的互补质粒,通过电转化敲除株ΔCRP,筛选CRP的基因回复互补株CΔCRP;比较分析突变株、野生株和回复互补株的基本生物学特征的差异,并以小鼠作为动物感染模型对突变株、互补株及野生株的毒力进行评估分析。结果:应用组合PCR和基因测序分析,证实构建了CRP的突变株ΔCRP,并筛选出CRP的回复互补株CΔCRP;逆转录PCR证实在突变株ΔCRP中CRP在转录水平缺失,而在回复互补株CΔCRP中其转录回复;在丰富营养情况下,突变株ΔCRP与野生株的溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力均无显著性差异,但突变株的成链能力减弱。结论:CRP编码基因的缺失并未显著改变野毒株05ZYH33的基本生物学特性和毒力,提示CRP可能不是猪链球菌的关键毒力决定因子,其参与碳源代谢等功能有待进一步研究。; 赵琳胡丹钟璟皓李娟龚秀芳潘秀珍王长军陈建华; 关键词：猪链球菌突变株毒力

2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA的原核表达及纯化被引量：3: 2016年; 目的利用原核表达系统制备2型猪链球菌细胞分裂起始因子DivIVA重组蛋白并进行纯化,为研究其在调控细胞分裂中的作用奠定基础。方法以2型猪链球菌05ZYH33全基因组为模板,PCR扩增divIVA基因片段,经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后将目的片段连接至表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a-divIVA,经测序鉴定后将重组质粒转化进入表达菌E.coli BL21,以终浓度为0.1mmol/L的IPTG于37℃培养4h,诱导DivIVA蛋白表达。用Ni离子亲和层析柱分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。结果成功构建重组表达质粒pET28a-divIVA,并在E.coli BL21中表达主要以包涵体形式存在的DivIVA蛋白。包涵体蛋白经8mol/L脲变性溶解后经Ni离子亲和层析柱纯化,获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测分子质量为36ku,与预期大小相符;经Western blot检测,该蛋白能被相应抗体特异性识别。结论在E.coli BL21中成功表达并纯化了DivIVA蛋白,为研究该蛋白在2型猪链球菌的细胞分裂机制奠定了基础。; 倪华过雨晴杜世仁张剑范伟伟孙卫平王长军曹祥荣潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌

2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶重组蛋白的制备及鉴定被引量：2: 2014年; 目的链球菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(serine/threonine phosphotase,STP)是重要的磷酸化信号调控系统成员之一。文中对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)STP编码基因stp进行原核表达并对纯化蛋白进行酶活测定。方法对S.suis 2 stp进行生物信息学分析,PCR扩增stp基因片段,构建重组表达载体pET28a::stp。将载体转入E.coli BL21中,经IPTG诱导,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用磷酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate,pNPP)为底物测定其水解量进而鉴定磷酸酶活性。结果从05ZYH33基因组中PCR扩增到810 bp的片段,经连接获得重组表达载体pET28a::stp;经诱导表达及纯化获得相对分子质量为32000的重组蛋白,该蛋白在Mn2+存在下能够水解pNpp。结论获得纯度较高的STP重组蛋白,该蛋白具有Mn2+依赖的磷酸酶活性,为后续阐明STK/STP磷酸化系统的调控机制打下基础。; 杜骁杰郭静静王晶李敏王玲王长军潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌

2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶对细菌生物学特性的影响被引量：3: 2014年; 猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌,有33个血清型[1].2型猪链球菌致病力最强,可引起脑膜炎、关节炎、败血症等[2].信号转导系统对细菌应对外界复杂的环境变化有着重要的作用.本课题组前期在对2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组测序的研究中发现和真核生物同源的丝氨酸/苏氨酸激酶stk,利用同源重组原理成功构建了stk基因敲除突变株[3],本文进一步研究stk缺失后细菌生物学特性的变化.; 杜骁杰倪华王玲郑峰胡丹王长军潘秀珍; 关键词：生物学特性苏氨酸激酶猪链球菌细菌信号转导系统人兽共患病

猪链球菌2型中国强毒株05ZYH33 ofs基因敲除突变株构建及其生物学特性研究被引量：1: 2014年; 目的探究猪链球菌血清浑浊因子ofs基因在强致病性2型猪链球菌致病过程中的作用。方法利用同源重组基因敲除方法构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为ofs编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,同源重组筛选ofs基因敲除突变株,通过组合PCR、Southern杂交和DNA测序对疑似突变株进行验证。生物学功能实验研究比较ofs突变株和野生株05ZYH33在革兰氏染色、菌落溶血活性、生长速率和毒力等方面的差异。结果组合PCR、Southern杂交和DNA测序结果均证实ofs基因敲除突变株05ZYH33Δofs构建成功,体外实验结果显示ofs基因缺失后菌株在革兰氏染色和菌落溶血活性及形态、生长速率等方面未发生改变,但小鼠毒力实验数据结果表明敲除突变株Δofs的毒力降低。结论猪链球菌2型ofs基因与细菌的毒力相关,本实验构建的突变株05ZYH33Δofs为进一步研究猪链球菌2型的致病机理奠定基础。; 李敏王晶史沛举郭静静杜骁杰李先富王长军潘秀珍高基民; 关键词：猪链球菌2型基因敲除生物特性毒力

2型猪链球菌Sao-M蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用被引量：5: 2016年; 目的制备并鉴定2型猪链球菌重组Sao-M蛋白的单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),为建立免疫学快速检测方法及Sao蛋白的功能研究奠定基础。方法用重组Sao-M蛋白免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术建立稳定分泌抗Sao-M蛋白的杂交瘤细胞株,制备抗Sao单克隆抗体,采用IgG亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的IgG亚型,采用间接ELISA法测定抗体效价。将05ZYH33与单抗共孵育,检测单克隆抗体与细菌表面具有天然构象Sao蛋白的结合能力。结果筛选到4株能持久、稳定分泌抗Sao蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(分别命名为1G5、1B10、2A10、3A6),均为IgG1型,ELISA测定腹水抗体效价>1︰102 400;4株单克隆抗体均能与05ZYH33表面天然构象的Sao蛋白结合,对细菌形态产生显著影响。结论成功制备高效价的抗Sao-M单克隆抗体,为建立快速检测猪链球菌感染的免疫学方法及Sao蛋白的功能研究奠定了基础。; 王晶李先富王长军高基民潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌单克隆抗体

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南京军区医学科技创新课题(ZX39)

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