国家自然科学基金(39870558)
- 作品数：11 被引量：25H指数：2
- 相关作者：王和平张雄杰徐枫蔺日胜周平更多>>
- 相关机构：内蒙古农业大学内蒙古天际绿洲特色生物资源研发中心更多>>
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- 相关领域：生物学农业科学轻工技术与工程化学工程更多>>
- β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达被引量：2
- 2007年
- 目的:实现β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达。方法:克隆猪肠道野生酵母菌JSY4的25S rDNA片段;并与YIP5经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切连接,构建载体YIP5-rDNA。BamHⅠ与SalⅠ双酶切YIP5-rDNA,EcoRⅠ与SalⅠ双酶切pGEM-ManⅠ得到ManⅠ基因,BglⅡ与EcoRⅠ双酶切pPIC9K得到AOX1启动子,将三个片段连接,构建高拷贝整合诱导型表达载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ。提取DNA用SalⅠ单酶切线性化与pAX15按3∶1的比例共转化JSY4,在含300μg/mlG418的YEPD平板上筛选工程菌转化子,PCR方法鉴定。用2%甲醇诱导共转化工程菌以实现表达。结果:成功表达出β-甘露聚糖酶,其比活力为0.90IU/ml。而且传代10次后仍能检测到ManⅠ基因的表达产物β-甘露聚糖酶。结论:实现了β-甘露聚糖酶基因随共转化工程菌染色体稳定遗传及表达的目的。
- 蔺日胜王和平周平武翠包晓兰赵丽霞
- 关键词：酵母菌Β-甘露聚糖酶
- 里氏木霉Rut-C30β-甘露聚糖酶基因表达载体的构建被引量：2
- 2003年
- 将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pGEM-ManΙ经EcoRΙ、绿豆芽核酸酶、HindⅢ酶切处理和纯化后,与含有Ω序列和T7启动子以及信号肽OmpT序列的分泌型表达载体pTOO2连接,将质粒pGEM-ManΙ中的β-甘露聚糖酶基因连接在pTOO2质粒信号肽OmpT之后,构建成表达载体pTOO2-ManΙ。将表达载体pTOO2-ManΙ转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,克隆转化子,pCR测序,结果获得了β-甘露聚糖酶编码的成熟肽cDNA,其序列与GeneBank报道完全一样。并从该克隆转化的大肠杆菌的周质中检测到了β-甘露聚糖酶的活性同时,证明β-甘露聚糖酶基因在分泌型过程中得到正确加工。
- 文静王和平鄂迎春周平
- 关键词：里氏木霉饲料利用率
- 里氏木霉RutC-30β-甘露聚糖酶的制备与纯化方法的研究被引量：16
- 2003年
- 里氏木霉以槐豆胶为基础培养基、以乳糖为诱导物,用7.5升液态发酵罐发酵产生β-甘露聚糖酶,经两次硫酸铵分级分离(饱和度为40％～60％)和两次聚丙烯酰胺凝胶制备电泳,结果得到高纯度均一的单体β-甘露聚糖酶,经SDS-PAGE测得酶分子量为53KD,比活力为100u/mg,这为β-甘露聚糖酶单克隆抗体的制备提供了高纯度的样品。
- 王和平范文斌张七斤王龙郭绥芝
- 关键词：里氏木霉纯化方法
- 木霉菌发酵羊胃容物产木聚糖酶的分离纯化及特性被引量：1
- 2011年
- 目的：为城市屠宰场牛羊胃容物类的生物垃圾型可再生资源的潜在工业化开发应用（城市无害鲜生物垃圾变废为宝的低碳生物循环经济工程）提供了部分可靠科学依据。方法：M-112木霉菌固态发酵羊胃容物的粗酶提取液，经20-60％饱和度的硫酸铵粗分级分离、SephadexG-25脱盐、SephadexG-150到SephadexG-100分子筛顺序纯化，通过蛋白质测定、酶活测定、SDS—PAGE和底物-PAGE电泳等。结果：制备到一种分子量约为64．7kDa的电泳纯木聚糖酶，其回收率为5．59％，纯化倍数10．43。比活力为253．36IU／mg。纯化出的木聚糖酶，经性质研究表明，其Km=11．20g／L，Vmax=0．70μmol／min；最适温度为65℃，最适pH为6．O，该酶在中温条件下稳定性好，在酸性至弱碱性（pH3．0～8．0）条件下稳定性好。结论：采用改良的凝胶色谱技术，首次纯化出木霉菌固态发酵羊胃容物所产的木聚糖酶。
- 徐枫王和平孙庆林张雄杰
- 关键词：木霉菌固态发酵木聚糖酶分离纯化
- 蜗牛肝脏β-甘露聚糖酶的分离提取及纯化鉴定被引量：3
- 2008年
- 从蜗牛肝脏组织制备粗酶液后,经硫酸铵分级分离和两次聚丙烯酰胺凝胶制备电泳,纯化到了蜗牛肝脏β-甘露聚糖酶。该酶经SDS-PAGE电泳分析显示为单一条带,其表观相对分子量为37KD。本法纯化的蜗牛肝脏β-甘露聚糖酶,比活力达到992.3U/mg,提纯倍数达8.45倍,回收率为25.12%。
- 赵娜王和平蔺日胜任旭荣杨逸隆
- 关键词：蜗牛Β-甘露聚糖酶制备电泳
- 屠宰羊胃容物对M-112木霉产孢活化制曲的影响被引量：1
- 2011年
- 为探索屠宰羊胃容物对M-112木霉产孢活化制曲的影响,为利用屠宰场牛羊胃内容物生产动物益生菌剂、植物生物防治剂、(半)纤维素酶制剂及其饲料提供科学的基础数据,采用屠宰羊胃容物对M-112木霉的菌丝体生长量、产孢数量、木聚糖酶活性、活化代数及制曲等进行了研究。结果表明:1)M-112木霉在不含羊胃内容物的培养基Ⅰ中生长的菌丝体重量比含12%羊胃容物培养基Ⅰ的重,在含18%和28%羊胃容物的培养基Ⅰ中对M-112木霉菌丝的生长有促进作用,而且28%比18%的促生长作用更加明显,大于28%羊胃容物含量的培养基Ⅰ对木霉菌的生长促进作用急剧下降。2)M-112木霉在纯培养基Ⅱ中产生的孢子数较少;在16%～18%羊胃容物的培养基Ⅱ中对M-112木霉菌产孢有明显的促进作用;大于26%羊胃容物的培养基Ⅱ对木霉菌产孢有抑制作用。3)M-112木霉在含46.62%羊胃容物培养基Ⅲ中进行活化培养,从第5代开始产木聚糖酶的酶活达到稳定状态,保持在12 000～12 500 U/mL。4)利用M-112木霉第5代活化菌种,在含羊胃容物17%的培养基Ⅲ中,按1∶5经2次放大制曲,其酶活逐步增加,最大酶活力达到12 454 U/mL。
- 张雄杰王和平李伟徐枫
- 关键词：木聚糖酶
- 转β-甘露聚糖酶基因大肠杆菌在猪肠道内的外泌型表达被引量：2
- 2006年
- 从里氏木霉R u t C-30提取总RNA,用RT-PCR方法克隆到β-甘露聚糖酶成熟肽cD-NA,并将其E coRΙ和B amH I酶切后连接到克隆载体pGEM进行测序,结果与G enB ank公布的完全一致,随后将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pGEM-M anΙ经E coRΙ、绿豆芽核酸酶、H indⅢ酶切处理和纯化后,与含有Ω序列和T 7启动子以及信号肽Om pT序列的分泌型表达载体pTOO 2连接,构建成表达载体pTOO 2-M an.Ι然后利用大肠杆菌素释放基因(k il)能有效的增加细菌外膜通透性促进周质蛋白外泌的原理,再将表达载体pTOO 2-M anΙ和质粒pUC 18-k il共转化到大肠杆菌BL 21株中,构建成外泌型表达体系BL 21-pTOO 2-M anΙ/pUC 18-k il进行外泌型表达.表达产物经酶活鉴定具有明显的β-甘露聚糖酶活性,经EL ISA双抗夹心法检测,无论在体外或猪肠道内容物内均为阳性,从而实现了该基因的外泌型表达;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,分子量为50.98 kD和53.98 kD,该工程菌通过瘘管灌注到猪肠道内进行表达研究,结果基本令人满意.从而实现了该转基因大肠杆菌在猪肠道中外泌型表达的目的.
- 王和平王龙文静高宏斌范文斌
- 关键词：Β-甘露聚糖酶RT-PCR
- β-甘露聚糖酶基因重组整合组成型表达载体的构建被引量：1
- 2007年
- 应用PCR方法从P.pastorisGS115染色体中扩增了GAP启动子(PGAP),大小为500bp左右,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的AOX1启动子(PAOX1),构建了组成型表达载体pGAP;再从野生型酵母菌JSY4染色体中扩增出25S rDNA保守序列,大小为1 700bp左右,以其取代组成型表达pGAP上的组氨酸脱氢酶基因(H IS4)片断,构建了整合组成型表达载体pGAP-rDNA。再双酶切重组质粒pT002M anⅠ得编码β-甘露聚糖酶的ManⅠ基因片断插入pGAP-rDNA的多克隆位点(MCS),获得含有目的基因ManⅠ的重组整合组成型表达载体pGAP-rDNA-ManⅠ。CaC l2法转化感受态大肠杆菌DH5α,对阳性克隆进行质粒PCR鉴定和单、双酶切鉴定。结果表明:成功构建了重组组成型表达载体pGAP-rDNA-ManⅠ,为下一步野生型酵母菌JSY4中β-甘露聚糖酶的组成型表达打下基础。
- 包晓兰王和平包力高周平蔺日胜赵丽霞
- 关键词：Β-甘露聚糖酶组成型表达GAP启动子
- 蜗牛嗉囊液木聚糖酶的脱盐技术比较
- 2010年
- 本实验通过透析法、超滤法、蛋白质回收装置脱盐法、Sephadex G-50柱脱盐法对盐析后的木聚糖酶液进行脱盐。用考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量[3],DNS法测定酶活力[5,6];用奈斯勒试剂法检测残留硫酸铵含量,计算脱盐效率。最后,对50%盐析梯度下样品的脱盐效率进行分析比较,得出Sephadex G-50柱脱盐法是蜗牛嗉囊液木聚糖酶的最佳脱盐工艺。
- 杨逸隆王和平任旭荣徐枫宋敏
- 关键词：蜗牛木聚糖酶
- M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶的条件优化
- 2011年
- 通过研究培养基料比、固液比、无机盐、接种量以及培养时间等单因素对M-112木霉固态发酵羊胃容物的影响,并采用正交实验设计优化了固态发酵条件。研究表明,M-112木霉固态发酵羊胃容物产木聚糖酶是可行的,影响产酶最主要的因素为接种量。优化的发酵条件为胃容物50%,玉米:麦麸=5:5,CaCl2浓度0.5%,初始pH值5.0,固液比1:3,每10 g干培养基接种量2 ml(孢子数1.2～1.6×108 cfu/ml),发酵时间72 h,发酵温度30℃。经优化后的酶活水平达到了138.504 IU/ml。较已报道的同种木霉的最高发酵酶活提高达3倍左右。
- 徐枫王和平孙庆林张雄杰宋敏
- 关键词：生物废弃物低碳经济木霉木聚糖酶固态发酵
